董 哲，楊玉玲，王素雅，馬 云，顧婷婷，楊智偉

（南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇南京210003）

草魚鹽溶蛋白凝膠結(jié)構(gòu)與質(zhì)構(gòu)特性研究

董 哲，楊玉玲﹡，王素雅，馬 云，顧婷婷，楊智偉

（南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇南京210003）

分析了草魚鹽溶蛋白的組成成分，對其凝膠微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察，并采用L9（34）正交實驗研究了鹽溶蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)特性，以期為草魚肉糜制品加工提供一些理論參考。結(jié)果顯示，鹽溶蛋白主要由肌球蛋白重鏈、肌動蛋白和兩條肌球蛋白輕鏈組成，分子量分別為190、53、30、17kDa。鹽溶蛋白凝膠呈粗糙的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。各因素對凝膠硬度和彈性的影響順序為：蛋白濃度＞離子強度＞Ca2+。鹽溶蛋白凝膠硬度的最優(yōu)組合為蛋白濃度24mg/mL、Ca2+濃度為0.08mol/L、離子強度為0.6。凝膠彈性的最優(yōu)組合為蛋白濃度24mg/mL、Ca2+濃度為0.08mol/L、離子強度為0.5。

草魚鹽溶蛋白，組分，微觀結(jié)構(gòu)，凝膠，質(zhì)構(gòu)

草魚是我國魚類中最常見的品種，每年產(chǎn)量在220萬t以上，居我國魚類養(yǎng)殖品種的首位。鹽溶蛋白（SSP）是魚肉中的主要蛋白質(zhì)（55%～60%），包括肌球蛋白、肌動蛋白、原肌球蛋白和肌鈣蛋白等[1]。鹽溶蛋白的凝膠特性對肉制品的品質(zhì)有很重要的影響，例如它的質(zhì)構(gòu)特性影響魚肉制品的硬度、彈性和嫩度等。影響蛋白凝膠特性的因素有很多，主要有離子強度及其類型、蛋白質(zhì)濃度、pH、溫度、肌肉類型等。白云等人發(fā)現(xiàn)兔肌球蛋白凝膠的硬度和彈性隨蛋白濃度的增加而增加[2]。Hermansson等指出，肌球蛋白在低離子強度下（0.25mol/L KCl）形成鏈狀凝膠結(jié)構(gòu)，而在高離子強度下（0.6mol/L KCl）形成粗糙的凝膠結(jié)構(gòu)，并認(rèn)為凝膠的質(zhì)構(gòu)特性很大程度上受凝膠結(jié)構(gòu)的影響[3]。鄧麗和芮漢明報道了0.6%的Ca2+能夠顯著提高凝膠硬度，但對凝膠彈性影響不大[4]。趙春青等人研究表明CaCl2對雞肉鹽溶蛋白凝膠硬度有顯著影響[5]。于巍和周堅研究了草魚鹽溶蛋白流變性質(zhì)及凝膠保水性[6]。在我國，草魚深加工水平較低，主要以鮮活類型銷售，限制了草魚的養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。目前我國對于草魚蛋白已有些許研究，但是對于草魚鹽溶蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)特性的研究還未見報道。本文研究了草魚鹽溶蛋白凝膠結(jié)構(gòu)和質(zhì)構(gòu)特性，以期為草魚肉糜制品品質(zhì)的提高提供一些理論參考，促進(jìn)草魚制品的開發(fā)，提高其附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮草魚 市售；NaCl、NaN3、Na5P3O10、CuSO4、NaOH等試劑 均為分析純；標(biāo)準(zhǔn)蛋白 SIGMA。

722 可見分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；GL-20B型高速冷凍離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；XT.Plus.TA，Stable Micro Sydtems UK；KTApurifier explorer 100Sweden；日立-S-3000N掃描電子顯微鏡 Japan；蛋白純化儀，1210/300GL色譜柱。

1.2 實驗方法

1.2.1 草魚鹽溶蛋白提取工藝 將新鮮魚肉去皮去刺后制成肉糜，將肉糜放入高速搗碎機中，加入4倍體積的洗液（0.1mol/L NaCl，1mmol/L NaN3）作勻漿處理。攪打6次，每次10s，間隔10s。將制成的勻漿離心（4000×g，20min）棄去上清液，得沉淀，重復(fù)上述操作步驟一次。得到的沉淀溶解于4倍體積的提取液中（適量NaCl，1mmol/L NaN3，0.01mol/L Na5P3O10），攪拌均勻，4°C靜置過夜。將勻漿液用2層紗布過濾，去掉結(jié)締組織，得到的濾液用稀釋液（1mmol/L NaN3，pH=7.4）稀釋10倍。稀釋后離心（10000×g，30min），得到的沉淀即為鹽溶蛋白。

1.2.2 蛋白濃度的測定 采用雙縮脲法在540nm下測定蛋白溶液的吸光度，以牛血清白蛋白（BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白[6]。

1.2.3 測定提取液中NaCl的最優(yōu)添加量 通過調(diào)整NaCl的添加量來設(shè)計提取液中離子強度分別為0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8，提取后測定不同離子強度下SSP的提取率。提取率=W1/W2，其中W1：SSP質(zhì)量；W2：魚肉總質(zhì)量。

1.2.4 鹽溶蛋白組分的測定 將樣品用流動相（0.25mol/L NaCl，50mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH=7.0）調(diào)整為2mg/mL，進(jìn)樣量50μL，設(shè)定流動相流速為0.25mL/min，在280nm下測定樣品吸收峰。

1.2.5 正交實驗 選用L9(34)正交表進(jìn)行正交實驗，因素水平見表1。

表1 正交實驗因素水平表

1.2.6 凝膠的制備 根據(jù)實驗設(shè)計配制不同條件的鹽溶蛋白溶液。水浴加熱到45°C時保溫15min，繼續(xù)升溫至75°C，加熱速度為1°C/min。取出，冷卻至室溫，在4°C放置2h，即得凝膠。

1.2.7 質(zhì)構(gòu)特性的測定 使用質(zhì)構(gòu)儀測定凝膠的硬度和彈性，測定條件：選用P/6探頭，測試前速度為5.00mm/s，測試速度為1.00mm/s，測試后速度為5.00mm/s，探頭深入距離為10mm。每個樣品重復(fù)三次，取平均值。

1.2.8 凝膠微觀結(jié)構(gòu)觀察 SSP凝膠加熱制成后冷卻至室溫，浸入20%的戊二醛溶液，備用。在15kV下，放大3000倍觀察凝膠的微觀結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取液離子強度的確定

提取液離子強度對鹽溶蛋白提取率的影響見表2。由表2可得，當(dāng)提取液離子強度為0.6時，SSP的提取率最高為4.73%，所以確定在鹽溶蛋白提取工藝中提取液的離子強度為0.6。

表2 提取液離子強度對提取率的影響

2.2 鹽溶蛋白組分的測定

圖1 鹽溶蛋白組分280nm吸收峰圖譜

圖1中，A、B、C、D四個點位標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量分別為200、130、66、43kDa。由蛋白純化儀分析樣品可以得出，草魚鹽溶蛋白主要有四個組分，分子量分別為190、53、30、17kDa，依次可能為肌球蛋白重鏈、肌動蛋白和兩條肌球蛋白輕鏈。Iwami和Tao分別研究了馬蘇大馬哈魚的肌球蛋白和草魚快肌的肌球蛋白，得到了相似的結(jié)論[7-8]。

2.3 凝膠微觀結(jié)構(gòu)的觀察

圖2 凝膠的微觀結(jié)構(gòu)

由圖2可以看出，凝膠形成粗糙的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，交聯(lián)緊密，孔洞分布不均勻，孔徑有大有小。Boyer等人發(fā)現(xiàn)，兔肌原纖維蛋白在高離子強度下也形成較粗糙的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[9]。

2.4 SSP凝膠特性分析

2.4.1 各因素對SSP凝膠彈性和硬度的影響

2.4.1.1 SSP濃度對凝膠彈性和硬度的影響 由圖3和圖4可以看出，在一定范圍內(nèi)，隨著鹽溶蛋白濃度的提高，其凝膠硬度和彈性均呈直線性增加。二者趨勢線方程分別為y=3.2713x-35.92，R2=0.9541；y=0.0595x-0.5674，R2=0.9751。SSP濃度的增加使蛋白分子間的間距變小，分子與分子更容易相互作用，因此增加了蛋白間凝聚的機會，交聯(lián)數(shù)目增加，因此凝膠硬度不斷提高，SSP凝膠彈性變化趨勢與硬度的相似，在蛋白加熱變性過程中蛋白分子鏈充分交聯(lián)，把自由水包埋在其中，形成立體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，較好的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)就會有較高的彈性[10]。

圖3 SSP濃度對凝膠硬度的影響

圖4 SSP濃度對凝膠彈性的影響

圖5 Ca2+對凝膠硬度的影響

2.4.1.2 Ca2+對SSP凝膠硬度、彈性的影響 由圖5和圖6可以看出：隨著Ca2+濃度的增加，SSP凝膠硬度呈直線上升，當(dāng)Ca2+添加量達(dá)到0.10mol/L時，比不添加時凝膠的硬度增加1倍。而其彈性則隨著Ca2+濃度的增加有所波動，當(dāng)Ca2+濃度在0.06mol/L時達(dá)到最小值，在0.10時達(dá)到最大值。一定濃度的Ca2+在適當(dāng)溫度下能夠激活蛋白中的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（TGase），催化谷氨酸殘基的γ-羧基酰胺基團(tuán)與其它氨基酸殘基發(fā)生交聯(lián)作用，使蛋白分子鏈間形成致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[11-13]。

圖6 Ca2+對凝膠彈性的影響

2.4.1.3 離子強度對SSP凝膠硬度、彈性的影響 由圖7和圖8可知，離子強度在0.6時凝膠硬度達(dá)到最大，而隨著離子強度的增大，凝膠硬度逐漸降低。在一定的范圍內(nèi)，隨著蛋白溶液離子強度的增加，凝膠硬度增加，這是由于鹽溶液能使鹽溶蛋白上的負(fù)電荷增加，蛋白分子間的斥力加強，間距加大；另一方面，高濃度的鹽打破了維持肌球蛋白、肌動蛋白，Z線、M線之間相互連接的力，這些正是限制肌原纖維膨脹的作用力。當(dāng)鹽溶蛋白溶液離子強度過高時，凝膠硬度逐漸下降，這可能是由于凝膠脫水引起的[14-16]。同時，離子強度在0.5時凝膠彈性達(dá)到最大，隨后彈性隨著離子強度增加先減小后增大。

圖7 離子強度對凝膠硬度的影響

圖8 離子強度對凝膠彈性的影響

2.4.2 鹽溶蛋白凝膠特性正交實驗分析 根據(jù)以上實驗結(jié)果，采用蛋白濃度、Ca2+濃度、離子強度作為三因素，以鹽溶蛋白凝膠硬度和彈性為指標(biāo)，進(jìn)行正交實驗分析，結(jié)果見表3。

由表3可知，第9號實驗（A3B3C1）得到的鹽溶蛋白凝膠硬度和彈性皆為最大值，即離子強度為0.6、Ca2+濃度為0.08mol/L、蛋白濃度為24mg/mL。

表3 凝膠質(zhì)構(gòu)特性正交實驗結(jié)果

表4 以硬度為指標(biāo)的極差分析

通過硬度的極差分析（表4）可以看出，各因素的最優(yōu)組合為A3B3C1，這與直觀分析最大值所得到的最優(yōu)組合一致，所以確定獲得凝膠硬度的最優(yōu)組合為A3B3C1。各因素對凝膠硬度的影響程度順序為：蛋白濃度＞離子強度＞Ca2+濃度。

表5 以彈性為指標(biāo)的極差分析表

通過彈性的極差分析（表5）可以看出，各因素的最優(yōu)組合為A3B2C1，這與直觀分析彈性最大值得到的最優(yōu)組合A3B3C1不一致，所以需要進(jìn)一步驗證實驗。各因素對凝膠彈性的影響程度順序為：蛋白濃度＞離子強度＞Ca2+濃度，這與硬度的影響順序是一致的。

2.4.3 驗證實驗 選擇A3B2C1做驗證實驗，重復(fù)測三次，得到彈性平均值為0.93，所以確定彈性的最優(yōu)組合為A3B2C1。

3 結(jié)論

鹽溶蛋白主要組分為肌球蛋白重鏈、兩條肌球蛋白輕鏈和肌動蛋白，分子量分別為190、53、30、17kDa。凝膠微觀結(jié)構(gòu)為粗糙的三維網(wǎng)絡(luò)狀。不同因素對草魚鹽溶蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)影響程度順序為蛋白濃度＞離子強度＞Ca2+濃度。

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Study on gel microstructure and properties of salt soluble proteins from grass carp

DONG Zhe,YANG Yu-ling*,WANG Su-ya,MA Yun,GU Ting-ting,YANG Zhi-wei

（Food College,Nanjing University of Finance&Economics,Nanjing 210003,China）

The compositions of salt soluble proteins(SSP)from grass carp were determined and the microstructures of SSP gel were observed.Furthermore，gel properties of SSP from grass carp was studied with L9(34)orthogonal test.The results showed there were four minor compositions in SSP，including myosin heavy chain，actin and two myosin light chains.Their molecular weights were 190，53，30，17kDa，respectively.The microstructure of the SSP gel was coarse.The different factors that affected the SSP gel hardness and springiness were SSP concentration ＞ ionic strength ＞ Ca2+，in the order of influential extent.The best conditions for hardness were protein concentration 24mg/mL，Ca2+concentration 0.08mol/L，ionic strength 0.6；The best conditions for springiness of SSP gel were protein concentration 24mg/mL，Ca2+concentration 0.08mol/L，ionic strength 0.5.

SSP of grass carp；compositions；microstructure；gelation；textural properties

TS254.1

A

1002-0306（2011）10-0177-04

2010-09-08 *通訊聯(lián)系人

董哲（1986-），女，碩士，研究方向：大分子蛋白性質(zhì)。