張 煒，謝志鵬，張建國

（浙江大學(xué)生物化學(xué)研究所，浙江杭州310058）

產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸菌Serratiasp.BK-98的分離及其培養(yǎng)條件優(yōu)化

張 煒，謝志鵬，張建國*

（浙江大學(xué)生物化學(xué)研究所，浙江杭州310058）

從土壤中分離得到一株2-酮基-D-葡萄糖酸（2-KDG）產(chǎn)生菌，綜合16S rDNA序列和系統(tǒng)進(jìn)化分析確定該菌屬于沙雷氏菌屬（Serratia），命名為Serratia sp.BK-98。 采用Plackett-Burman（PB）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，從影響2-酮基-D-葡萄糖酸生物合成條件的14個(gè)因素中篩選出具有顯著效應(yīng)的3個(gè)因子：裝液量、發(fā)酵時(shí)間和初始pH。在此基礎(chǔ)上通過中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)（central composite design,CCD）和響應(yīng)面分析（response surface methodology,RSM）確定了裝液量、發(fā)酵時(shí)間和初始pH的最適值分別為6.6mL、57.9h和5.0。在優(yōu)化條件下，2-KDG的100mL搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到了187.8g/L，100L發(fā)酵罐產(chǎn)量達(dá)到了192.2g/L，分別較優(yōu)化前提高了142.6%和148.3%，這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均與模型的預(yù)測值191.4g/L非常接近。

培養(yǎng)條件，2-酮基-D-葡萄糖酸，優(yōu)化，響應(yīng)面法，Serratia sp.BK-98

2 -酮基-D-葡萄糖酸（2-KDG）有著廣泛的用途，它能被用作食品添加劑、水泥增塑劑、洗滌劑，是照片顯影劑的重要成分[1]；同時(shí)它也是除草劑[2]、D-核酮糖、D-阿拉伯糖，特別是D-異抗壞血酸合成過程中的重要前體[3]。2-KDG的生產(chǎn)方法主要有三種：發(fā)酵法、化學(xué)合成法和酶促法。由于微生物發(fā)酵法生產(chǎn)2-KDG具有操作簡單、副產(chǎn)物少、生產(chǎn)成本低、反應(yīng)條件溫和、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)而備受國內(nèi)外研究人員的青睞。自1935年Bernhauer和G?rlich[4]從葡萄糖酸桿菌（Bacterium gluconicum）的發(fā)酵液中分離出2-KDG以來，許多具有2-KDG生產(chǎn)能力的菌株相繼被報(bào)道，如熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）[5]，粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）[6]，產(chǎn)酮產(chǎn)堿菌（Alcaligenes ketogenes）[7]。合適的培養(yǎng)條件對提高發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量至關(guān)重要。響應(yīng)面分析法是20世紀(jì)中后葉發(fā)展起來的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，相比傳統(tǒng)的單因子和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，響應(yīng)面分析法具有實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、周期短，求得的回歸方程精度高、能研究幾種因素間交互作用等優(yōu)點(diǎn)，優(yōu)化效率高，在微生物培養(yǎng)條件優(yōu)化方面已有廣泛應(yīng)用[8-10]。本文從土壤中篩選得到一株具有生產(chǎn)2-KDG能力的菌株，結(jié)合16S rDNA序列和系統(tǒng)進(jìn)化分析表明該菌屬于沙雷氏菌屬（Serratia），以此菌株為出發(fā)菌株，采用響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）對其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。首先采用Plackett-Burman（PB）設(shè)計(jì)篩選出影響沙雷氏菌發(fā)酵的重要因素，然后通過中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)（central composite design，CCD）和響應(yīng)面分析對這些重要因素進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳的發(fā)酵條件，為后續(xù)放大實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

篩選培養(yǎng)基（g/L） 葡萄糖200，酵母膏5，自然pH；固體培養(yǎng)基（g/L） 葡萄糖200，酵母膏5，瓊脂20，自然pH；種子培養(yǎng)基（g/L） 葡萄糖10，酵母膏3，蛋白胨10，牛肉膏3，MgSO4·7H2O 3，pH=6.7；初始發(fā)酵培養(yǎng)基 （g/L） K2HPO40.7，KH2PO40.7，MgSO4·7H2O 0.3，葡萄糖200，工業(yè)魚蛋白胨19，尿素1.5，CaCO350，pH=6.7。所有培養(yǎng)基滅菌條件均為115℃滅菌20min。

SW-CJ-1FD型潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LXQ-LS-SII型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；PHSJ-3F型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 上海精科實(shí)業(yè)有限公司；XS-205型電子天平瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)；LHZ-111型落地式恒溫振蕩器 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Agilent-1200高效液相色譜儀 美國Agilent公司；薄層層析硅膠板青島海洋化工廠分廠；100L發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備工程有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的分離和鑒定 將從浙江省杭州市收集的菜園土壤放入盛有篩選培養(yǎng)基的搖瓶中，在30℃，250r/min搖床中培養(yǎng)72h，然后根據(jù)稀釋平板法將培養(yǎng)液涂布在盛有固體培養(yǎng)基的平板中，30℃培養(yǎng)48h。將得到的單菌落保藏，并篩選2-KDG產(chǎn)量最高的菌株。根據(jù)該菌株的16S rDNA基因中的特異保守序列設(shè)計(jì)PCR引物，擴(kuò)增該菌株的16S rDNA基因，通過測序并用CLUSTALW 1.6.A軟件將序列與Eztaxon（http://www.eztaxon.org/）中已知16S rDNA序列進(jìn)行多序列比對，然后根據(jù)鄰接法用MEGA 4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，初步確定該菌株在分類學(xué)中的位置。

1.2.2 培養(yǎng)條件 種子培養(yǎng)條件：將保藏的斜面菌種接種到盛有25mL種子培養(yǎng)基的100mL搖瓶中，在28℃，250r/min搖床中培養(yǎng)21h。優(yōu)化前的發(fā)酵培養(yǎng)條件：取種子培養(yǎng)液以7%（v/v）接種量接入盛有20mL發(fā)酵培養(yǎng)基的100mL搖瓶中，在28℃，230r/min搖床中培養(yǎng)62h。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

表1 PB實(shí)驗(yàn)各因素水平

表2 N=20的PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

1.2.3.1 PB設(shè)計(jì) 影響2-KDG產(chǎn)量的可能因素有K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、工業(yè)魚蛋白胨、尿素、CaCO3等的濃度，以及接種量、溫度、裝液量、發(fā)酵時(shí)間、初始pH、種齡、搖床轉(zhuǎn)速等。實(shí)驗(yàn)選用N=20的PB設(shè)計(jì)安排，對這14個(gè)因素進(jìn)行研究，另設(shè)4個(gè)因素為虛擬變量，用于估計(jì)誤差，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的每個(gè)因素取兩個(gè)水平，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)來確定，各因素水平取值見表1，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表見表2。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，最后取平均值。

1.2.3.2 中心組合設(shè)計(jì) 根據(jù)PB設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)篩選出的具有顯著效應(yīng)的因素，采用中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表見表3。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，最后取平均值。采用軟件Minitab 15.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析。

表3 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

1.2.4 2 -KDG的分析方法 2-KDG的定性分析采用薄層層析（TLC）法：展開劑為吡啶:乙酸乙酯∶乙酸∶水（5∶5∶1∶3，v/v），顯色劑為0.2%鄰苯二胺酒精溶液（含1%濃硝酸）[11]，硅膠板在使用前先在105℃烘箱中烘20min。

2 -KDG的定量測定采用高效液相色譜法（HPLC）：參考文獻(xiàn)[12]。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)2-KDG菌株的分離和鑒定

從土壤中分離出來的單菌落經(jīng)過搖瓶培養(yǎng)后先用TLC篩選出能產(chǎn)2-KDG的菌株，之后再用HPLC篩選出2-KDG產(chǎn)量最高的菌株BK-98用于進(jìn)一步的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。測序結(jié)果表明該菌株的16S rDNA片段約1456bp，16S rDNA基因序列在GenBank的登錄號(hào)HM565931。將該序列與Eztaxon（http://www.eztaxon.org/）中已知16S rDNA序列進(jìn)行多序列比對，構(gòu)建以16S rDNA序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。結(jié)果表明，BK-98與沙雷氏菌屬（Serratia）同源性很高，與Serratia nematodiphila同源性更是達(dá)到99.656%（GenBank登錄號(hào)EU036987）。因此，可以初步確定BK-98屬于沙雷氏菌屬（Serratia），并將該菌株命名為Serratiasp.BK-98。

圖1 鄰接法構(gòu)建的基于16S rDNA基因序列的菌株Serratia sp.BK-98與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，括號(hào)里的數(shù)值為Genbank登錄號(hào)，分支處的數(shù)值為自展值

2.2 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選重要因素

采用PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)從眾多影響Serratiasp.BK-98發(fā)酵的因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個(gè)因素，供進(jìn)一步研究用。PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。對表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，分析結(jié)果見表4。

表4 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的回歸分析

由表4可知，此回歸模型的決定系數(shù)R2為97.99%，表明模型構(gòu)建非常成功。由表1可知，對2-KDG發(fā)酵過程有顯著影響的因素有裝液量、發(fā)酵時(shí)間、初始pH、搖床轉(zhuǎn)速和溫度，它們的效應(yīng)分別為47.54，30.44，25.84，24.18和12.18。其中裝液量、初始pH和溫度對產(chǎn)2-KDG的影響呈現(xiàn)出負(fù)效應(yīng),發(fā)酵時(shí)間和搖床轉(zhuǎn)速對產(chǎn)2-KDG的影響呈現(xiàn)出正效應(yīng)。圖2進(jìn)一步顯示了各個(gè)因素的顯著性水平。由于三個(gè)以上的因素會(huì)大量地增加CCD實(shí)驗(yàn)的次數(shù)，一般選擇不超過三個(gè)的因素做CCD實(shí)驗(yàn)[13]。故本文選擇影響效應(yīng)最大的三個(gè)因素（裝液量，發(fā)酵時(shí)間和初始pH）進(jìn)行CCD實(shí)驗(yàn)。搖床轉(zhuǎn)速和溫度兩個(gè)因素則根據(jù)正負(fù)效應(yīng)水平，搖床轉(zhuǎn)速取高水平值，溫度取低水平值。

圖2 影響2-KDG產(chǎn)量的14個(gè)因素效應(yīng)的帕累托圖

2.3 RSM法優(yōu)化2-KDG發(fā)酵條件

采用中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確定三個(gè)顯著因素（裝液量、發(fā)酵時(shí)間和初始pH）的最優(yōu)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。對所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析得到以下二次多項(xiàng)式模型：

其中Y代表2-KDG的產(chǎn)量，C、E和F分別代表裝液量、發(fā)酵時(shí)間和初始pH。

回歸模型的方差分析見表5，F(xiàn)檢驗(yàn)P=0.000說明回歸在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是非常顯著的，同時(shí)，該模型失擬項(xiàng)的P值大于0.05，說明該模型失擬不顯著。此外，該模型的決定系數(shù)R2=0.9717，說明回歸方程的擬合程度很好，可以應(yīng)用于Serratia sp.BK-98發(fā)酵生產(chǎn)2-KDG的分析和預(yù)測。

表5 二次多項(xiàng)式模型的方差分析

回歸模型中各項(xiàng)的系數(shù)估計(jì)見表6，從表6可知，一次項(xiàng)中C和E對2-KDG發(fā)酵有顯著影響，二次項(xiàng)中CF對2-KDG發(fā)酵有顯著影響，其余項(xiàng)對2-KDG發(fā)酵的影響不顯著。響應(yīng)面圖3～圖5直觀地反映了各個(gè)因素對響應(yīng)值的影響。圖3說明裝液量對2-KDG產(chǎn)量的影響極大，當(dāng)裝液量增大時(shí)，2-KDG產(chǎn)量迅速減少。這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Misenheimer等人[6]的報(bào)道一致。從圖中可以看出當(dāng)裝液量為10mL時(shí)，2-KDG的產(chǎn)量為175.1g/L，當(dāng)裝液量為20mL時(shí)，2-KDG的產(chǎn)量快速減少為106.3g/L。這可能是因?yàn)檠b液量過大，溶氧濃度迅速下降，當(dāng)發(fā)酵液中的溶氧濃度降至臨界氧濃度以下，糖代謝受到了顯著的影響。圖4表明發(fā)酵時(shí)間也顯著地影響2-KDG產(chǎn)量。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間大于68h，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，2-KDG產(chǎn)量明顯增加。圖5反映了初始pH和裝液量的交互效應(yīng)。初始pH和裝液量均與2-KDG產(chǎn)量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，2-KDG產(chǎn)量隨著初始pH和裝液量的減少而顯著增加。

用Minitab軟件求解方程得到裝液量、發(fā)酵時(shí)間和初始pH的最佳條件分別為6.6mL，57.9h和5.0。在此最佳條件下，模型預(yù)測的2-KDG產(chǎn)量為191.4g/L。

表6 CCD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的回歸分析

圖3 C和E對2-KDG產(chǎn)量影響的響應(yīng)面圖

圖4 E和F對2-KDG產(chǎn)量影響的響應(yīng)面圖

圖5 C和F對2-KDG產(chǎn)量影響的響應(yīng)面圖

2.4 模型驗(yàn)證

為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確性，在優(yōu)化條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，經(jīng)三批100mL搖瓶培養(yǎng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，所得的2-KDG產(chǎn)量平均值為187.8g/L；此外，進(jìn)一步在100L發(fā)酵罐上進(jìn)行了三批重復(fù)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)RSM優(yōu)化結(jié)果可知Serratia sp.BK-98在發(fā)酵生產(chǎn)2-KDG過程中需氧量較大，故設(shè)定通氣量為4.0m3/h，罐壓為0.05MPa，裝液量為55L，通過轉(zhuǎn)速與溶氧串級使整個(gè)發(fā)酵過程中溶氧維持在10%以上，其他條件同搖瓶實(shí)驗(yàn)，最終2-KDG產(chǎn)量平均值為192.2g/L。搖瓶與發(fā)酵罐的實(shí)驗(yàn)值均與理論預(yù)測值非常接近，可見該模型可以較好地預(yù)測實(shí)際發(fā)酵情況。

3 結(jié)語

本文從土壤中分離篩選得到一株能產(chǎn)2-KDG的菌株，綜合16S rDNA序列和系統(tǒng)進(jìn)化分析確定該菌屬于沙雷氏菌屬（Serratia），并將該菌株命名為Serratia sp.BK-98。本文采用PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)面法相結(jié)合的方法優(yōu)化Serratia sp.BK-98產(chǎn)2-KDG的發(fā)酵條件，從眾多的影響因子中快速有效地篩選出主要影響因子并實(shí)現(xiàn)其水平的優(yōu)化。優(yōu)化后的Serratia sp.BK-98產(chǎn)2-KDG的最佳發(fā)酵條件為：裝液量6.6mL，發(fā)酵時(shí)間為57.9h，初始pH為5.0，接種量7%（v/v），溫度26℃，種齡21h，搖床轉(zhuǎn)速260r/min，K2HPO40.7g/L，KH2PO40.7g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，葡萄糖200g/L，工業(yè)魚蛋白胨19g/L，尿素1.5g/L，CaCO350g/L。在此優(yōu)化條件下，經(jīng)過三批100mL搖瓶培養(yǎng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，所得的平均值為187.8g/L，進(jìn)一步的三批裝液量為55L的100L發(fā)酵罐重復(fù)實(shí)驗(yàn)，所得的平均值為192.2g/L，兩者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均與模型的預(yù)測值191.4g/L十分接近，與優(yōu)化前的原始發(fā)酵條件下2-KDG的產(chǎn)量77.4g/L相比，搖瓶和發(fā)酵罐的2-KDG產(chǎn)量分別提高了142.6%和148.3%，這為進(jìn)一步的發(fā)酵放大實(shí)驗(yàn)和工業(yè)化應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。

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Optimization of culture conditions for producing 2-keto-D-gluconic acid by an isolated strain of Serratia sp.BK-98

ZHANG Wei,XIE Zhi-peng,ZHANG Jian-guo*

（Institute of Biochemistry,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China）

A strain capable of producing 2-keto-D-gluconic acid (2-KDG)was isolated from soil.The phylogenetic analysis based on 16S rDNA suggested the isolate was assigned to genus Serratia and named Serratia sp.BK-98.Medium loading volume，fermentation time and initial pH were found to be most significant factors affecting 2-KDG production using Plackett-Burman (PB)design and their values were optimized to be 6.6mL in a 100mL Erlenmeyer flask of medium loading volume，57.9h of fermentation time and 5.0 of initial pH respectively with response surface methodology(RSM)based on central composite design (CCD).Under the optimized fermentation conditions，2-KDG production in a 100mL Erlenmeyer flask and in a 100L fermenter reached 187.8g/L and 192.2g/L respectively，142.6%and 148.3%increase respectively as compared with the pre-optimized conditions.A close agreement with the predicted value of 191.4g/L indicated that the proposed relationship model between the impact factors and 2-KDG production was very practical.

culture conditions； 2-keto-D-gluconic acid； optimization； response surface methodology； Serratia sp.BK-98

TS201.3

A

1002-0306（2011）10-0264-05

2010－09－28 * 通訊聯(lián)系人

張煒（1986-），男，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程。