劉亞南，張志勝，孫克巖，佟海菊，宋 欣

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071000）

中性蛋白酶酶解提取牡蠣牛磺酸工藝條件研究

劉亞南，張志勝*，孫克巖，佟海菊，宋 欣

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071000）

研究了中性蛋白酶酶解溫度、加酶量、pH、料液比對(duì)牡蠣中?；撬崽崛」に嚄l件的影響。結(jié)果表明：酶解溫度40℃，加酶量1000u/g，pH7.2，料液比1∶9（g/L），在此條件下酶解5h，測(cè)得?；撬崽崛×窟_(dá)到2.623mg/g。

中性蛋白酶，牡蠣，牛磺酸

?；撬嵊置Ｄ懰幔侨梭w非必需氨基酸之一。?；撬嶂饕杂坞x形式廣泛存在于動(dòng)物的組織細(xì)胞內(nèi)[1]。在海洋生物中含量尤為豐富，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[2]，每千克鮮牡蠣中含?；撬峒s4～8g。?；撬峋哂袕V泛的生理功能，如參與滲透調(diào)節(jié)、抗氧化、解毒和刺激糖酵解等[3]，對(duì)維持機(jī)體的正常生長(zhǎng)發(fā)育、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、視覺系統(tǒng)、血液、免疫和生殖系統(tǒng)的功能有著重要的作用[4-6]。目前，國(guó)內(nèi)外?；撬岬闹迫《嗖捎没瘜W(xué)合成，但化學(xué)合成成本高，污染嚴(yán)重，因此從天然產(chǎn)物中提取牛磺酸備受關(guān)注。牡蠣為我國(guó)四大經(jīng)濟(jì)貝類之一，營(yíng)養(yǎng)豐富，富含氨基酸、蛋白質(zhì)、維生素及微量元素等[5-6]，近年來對(duì)牡蠣中牛磺酸的提取多采用水煮法。本文以牡蠣為原料，利用中性蛋白酶酶解提取，以牛磺酸提取量為指標(biāo)，確定了中性蛋白酶的最適宜酶解工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牡蠣 由唐山豐瑞水產(chǎn)食品有限公司提供；枯草芽孢桿菌中性蛋白酶（以下稱中性蛋白酶，標(biāo)注酶活為60000u/g） 索來寶科技有限公司；?；撬針?biāo)準(zhǔn)樣（≥99%） 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；其他試劑 均為分析純。

UV2800H紫外分光光度計(jì) 尤尼科（上海）儀器有限公司；HH-4電熱恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司；DELTA320精密pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；79-1磁力攪拌器 金壇市醫(yī)療儀器廠；JJ-2組織搗碎均漿機(jī)（2003-61） 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；GL2G2Ⅱ立式冷凍離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ?；撬崽崛》椒╗7]新鮮牡蠣肉清洗均漿，稱取一定量的均漿肉，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案確定的實(shí)驗(yàn)參數(shù)調(diào)整酶解溫度、加酶量、pH、料液比，將均漿液在水浴鍋中預(yù)熱15min，然后按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案添加中性蛋白酶恒溫酶解5h，期間每10min用玻璃棒攪拌一次，酶解完成后樣品在沸水浴中滅酶10min，冷卻，在6000r/min下離心15min，取上清液測(cè)定?；撬岷?。

1.2.2 ?；撬岷繙y(cè)定

1.2.2.1 牛磺酸檢測(cè)方法[8]在醋酸鈉的作用下，?；撬崤c乙酰丙酮和甲醛加熱反應(yīng)生成黃色配合物，其吸光度與?；撬岬臐舛仍谝欢ǚ秶鷥?nèi)呈正比。顯色劑的配制：10mL NaAC（1mol/L）、0.6mL乙酰丙酮、0.4mL甲醛用水定容至25mL。測(cè)定時(shí)在10mL試管中加入1mL樣液，1.5mL顯色劑和2.5mL水，用棉塞封住口，100℃下水浴15min，冷卻后在400nm下測(cè)定?；撬岷?。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定 取不同量的牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照實(shí)驗(yàn)方法，加入顯色劑顯色，發(fā)現(xiàn)牛磺酸濃度在0～0.3mg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈線性關(guān)系，擬合線形方程為y=2.0207x+0.0054，R2=0.9989。

1.2.3 ?；撬崽崛」に嚄l件的優(yōu)化 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用L9（34）正交表，以溫度、加酶量、pH、料液比選取四因素三水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析及顯著性檢驗(yàn)，以確定最佳的提取工藝條件，各因素水平如表1所示。

表1 中性蛋白酶酶解正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與討論

2.1 影響?；撬崽崛×康膯我蛩貙?shí)驗(yàn)

2.1.1 溫度對(duì)?；撬崽崛×康挠绊?在加酶量1200u/g，pH7.2，料液比1∶9的條件下，酶解5h，不同酶解溫度對(duì)?；撬崽崛×康挠绊懭鐖D1所示。由圖1可知，在一定范圍內(nèi)，隨著溫度的升高?；撬崽崛×恳搽S之增大，45℃時(shí)達(dá)到最大，為2.45mg/g，之后隨提取溫度繼續(xù)升高，?；撬崽崛×砍式档偷内厔?shì)。

圖1 溫度對(duì)?；撬崽崛×康挠绊?/p>

2.1.2 加酶量對(duì)?；撬崽崛×康挠绊?在溫度45℃，pH7.2，料液比1∶9的條件下，酶解5h，不同加酶量對(duì)?；撬崽崛×康挠绊懭鐖D2所示。由圖2可知，隨著加酶量的增加，牛磺酸提取量也隨之增加，加酶量在1200u/g時(shí)，增幅量最大，此時(shí)?；撬崽崛×繛?.50mg/g，隨后趨于平穩(wěn)。因此，為節(jié)省成本選取加酶量為1200u/g。

圖2 加酶量對(duì)?；撬崽崛×康挠绊?/p>

2.1.3 pH對(duì)?；撬崽崛×康挠绊?在溫度45℃，加酶量1200u/g，料液比1:9的條件下，酶解5h，不同pH對(duì)牛磺酸提取量的影響如圖3所示。由圖3可知，隨著pH的升高，?；撬崽崛×恳搽S之升高，在pH為7.2左右時(shí)達(dá)到最大，約為2.63mg/g。但是隨著pH的繼續(xù)升高，提取量明顯下降，因此選取pH為7.2。

圖3 pH對(duì)?；撬崽崛×康挠绊?/p>

2.1.4 料液比對(duì)?；撬崽崛×康挠绊?在溫度45℃，加酶量1200u/g，pH7.2的條件下，酶解5h，不同料液比對(duì)?；撬崽崛×康挠绊懭鐖D4所示。由圖4可知，隨著提取液用量的增加，?；撬崽崛×坎粩嗑徛?，料液比為1∶9（g/L）時(shí)?；撬崽崛×繛?.35mg/g，1∶11時(shí)為2.55mg/g?？紤]到成本因素及提取后的純化工作，料液比選為1∶9（g/L）。

圖4 料液比對(duì)?；撬崽崛×康挠绊?/p>

2.2 中性蛋白酶酶解提取工藝優(yōu)化結(jié)果

表2 L9（34）中性蛋白酶酶解實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果

中性蛋白酶酶解正交實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果如表2所示。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，?；撬岷孔罡叩拿附夤に嚱M合為A1B2C2D2，提取量可達(dá)2.62mg/g（鮮肉）。應(yīng)用SPSS軟件對(duì)正交實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

由表3可知，影響?；撬崽崛『康闹鞔我蛩厥牵簻囟龋緋H＞料液比＞加酶量。顯著性檢驗(yàn)表明，溫度、時(shí)間和料液比對(duì)?；撬崽崛×康挠绊懚歼_(dá)到了極顯著水平（p＜0.01），加酶量在實(shí)驗(yàn)因素水平范圍內(nèi)對(duì)實(shí)驗(yàn)沒有顯著性影響。正交實(shí)驗(yàn)中最適宜酶解工藝組合為A1B2C2D2，因素A、C、D對(duì)?；撬崽崛×慷加酗@著性影響，因此因素A取40℃，因素C取7.2，因素D取1∶9（g/L）；因素B對(duì)實(shí)驗(yàn)無顯著性影響，且加酶量從1000u/g到1200u/g，?；撬岷肯嗖畈淮螅用噶繛?000u/g時(shí)?；撬崽崛×繛?.623mg/g，加酶量為1200u/g時(shí)牛磺酸提取量為2.628mg/g），考慮到節(jié)省成本，選取加酶量為1000u/g（鮮肉）。綜上所述，中性蛋白酶酶解提取?；撬岬淖钸m宜工藝為：溫度40℃，加酶量1000u/g（鮮肉），pH7.2，料液比1∶9（g/L）。

表3 中性蛋白酶酶解實(shí)驗(yàn)方差分析

3 結(jié)論

本文研究了中性蛋白酶酶解牡蠣提取牛磺酸的工藝條件，得出影響牛磺酸提取量的主次因素是溫度、pH、料液比、加酶量。最佳工藝條件為：溫度40℃，加酶量1000u/g（鮮肉），pH7.2，料液比1:9（g/L），在此條件下水解5h，?；撬崽崛×繛?.623mg/g（鮮肉）。

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Study on extraction of taurine from oyster with neutral protease

LIU Ya-nan,ZHANG Zhi-sheng*,SUN Ke-yan,TONG Hai-ju,SONG Xin

（College of Food Science and Technology,Agricultural University of Hebei,Baoding 071000,China）

The effect of the enzyme temperature，enzyme added，pH and soid-liquid was studied for extraction of taurine.The result indicated that the optimal technological conditions of extracting taurine was:hydrolysis at temperature 40℃，quantity of enzyme E/S=1000u/g，pH 7.2，solid and liquid ration 1∶9，hydrolisis time 5h.the yielding content of taurine was 2.623mg/g from the verifying experiment under this optimume condition.

neutral protease； oyster； taurine

TS254.1

B

1002-0306（2011）10-0308-03

2010－11－26 * 通訊聯(lián)系人

劉亞南（1984-），女，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。

國(guó)家海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（200805046）。