趙 靜，段楊峰，孔繁淵，申 杰，吳 新，金文淵，鄭永華,*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.蘇州大福外貿(mào)食品有限公司，江蘇 蘇州 215111)

超聲波輔助提取枇杷核苦杏仁苷工藝優(yōu)化

趙 靜1，段楊峰1，孔繁淵1，申 杰1，吳 新1，金文淵2，鄭永華1,*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.蘇州大福外貿(mào)食品有限公司，江蘇 蘇州 215111)

為優(yōu)化枇杷核中苦杏仁苷超聲波輔助提取工藝，采用單因素和二水平試驗(yàn)研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間、液料比和超聲波功率5個(gè)因素對(duì)苦杏仁苷提取量的影響，在此基礎(chǔ)上應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)超聲波提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、提取溫度60℃、提取時(shí)間30min、液料比12:1(mL/g)、超聲波功率250W。此條件下苦杏仁苷的提取量為39.07mg/g，與模型預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.66%，說(shuō)明此模型的預(yù)測(cè)精度較高。這些結(jié)果為超聲波輔助提取技術(shù)在枇杷核苦杏仁苷提取中的應(yīng)用提供了依據(jù)。

枇杷核；苦杏仁苷；超聲波輔助提??；條件優(yōu)化；響應(yīng)面法

枇杷是我國(guó)特產(chǎn)水果，目前年產(chǎn)量為40～60萬(wàn)噸，按果核占果質(zhì)量的20%計(jì)算，每年會(huì)產(chǎn)生3～4萬(wàn)噸的枇杷核廢棄物，不僅造成資源浪費(fèi)，而且污染環(huán)境。枇杷核的主要成分是淀粉，此外還含有苦杏仁苷，它具有鎮(zhèn)咳平喘和抗腫瘤等多種生物活性[1-3]。因此，利用枇杷核提取苦杏仁苷，對(duì)枇杷資源的綜合利用具有重要意義。

目前，對(duì)苦杏仁中苦杏仁苷提取方法的研究較多，常用的有水提[4]、有機(jī)溶劑提取[5]和超臨界CO2萃取法[6]等。水和有機(jī)溶劑浸提法耗時(shí)長(zhǎng)、得率低；超臨界CO2萃取法雖然具有選擇性高、有效成分易分離等優(yōu)點(diǎn)[7]，但提取成本高，生產(chǎn)應(yīng)用受到限制。超聲波可破壞細(xì)胞壁，增加溶劑穿透力，從而提高提取率和縮短提取時(shí)間，被廣泛用于植物天然產(chǎn)物的提取[8-13]。二水平試驗(yàn)法可從眾多的考察因素中快速而有效地篩選出主要的影響因子，故而被廣泛用于因子主效應(yīng)的確定[14]。響應(yīng)曲面法能夠精確地研究各因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系，近年來(lái)已成功應(yīng)用于蕃茄中茄紅素[15]和西瓜種子中蛋白質(zhì)[16]提取工藝條件的優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)曲面法研究不同超聲波輔助提取條件對(duì)枇杷果核中苦杏仁苷提取量的影響，以確定枇杷果核苦杏仁苷提取的最優(yōu)條件，為超聲波輔助提取技術(shù)在枇杷果核苦杏仁苷提取中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

取成熟“解放鐘”枇杷(Eriobotryai japonica Lindl. cv. Jiefangzhong)果實(shí)果核，用流通蒸汽滅酶[17]，破碎后備用?？嘈尤受諛?biāo)準(zhǔn)品(98%) 南京澤朗醫(yī)藥科技集團(tuán)有限公司；乙醇(分析純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JA2003電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；KQ-500DE、KQ-250B型數(shù)控超聲波清洗器(超聲工作頻率為40kHz，頻率不可調(diào)，超聲換能器位于清洗槽底部，每個(gè)超聲換能器發(fā)射功率為50W) 昆山市超聲儀器有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠；UV-1600型分光光度計(jì)上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

稱取苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)品10mg加無(wú)水乙醇溶解，定容至100mL，即為100μg/mL苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別量取標(biāo)準(zhǔn)溶液5、10、15、20、25mL用無(wú)水乙醇定溶至50mL。隨后，在波長(zhǎng)207nm處測(cè)定其吸光度并繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為Y=0.0163X＋0.0145(R2=0.999)。1.3.2 苦杏仁苷提取量的測(cè)定

1.0 g樣品仔細(xì)研磨后加入乙醇溶液進(jìn)行超聲波輔提取，隨后將提取液真空濃縮至干燥，并用無(wú)水乙醇溶解，在波長(zhǎng)207nm處測(cè)定吸光度，運(yùn)用回歸方程計(jì)算測(cè)定液中苦杏仁苷濃度，換算成提取量。

1.4 苦杏仁苷提取試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 單因素試驗(yàn)

報(bào)道[5,18-20]，分別以不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間、液料比和超聲波功率做單因素試驗(yàn)，考察各單因素對(duì)苦杏仁苷提取量的影響。

1.4.2 二水平試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的研究基礎(chǔ)上，選取影響苦杏仁苷提取量的乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間、液料比和超聲波功率5因素進(jìn)行二水平試驗(yàn)，以苦杏仁苷提取量為響應(yīng)值，來(lái)篩選主要影響因素。

1.4.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素和二水平試驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比和超聲波功率3因素，以苦杏仁苷提取量為響應(yīng)值，通過(guò)Design-Expert 7.1.3軟件，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)這些主要影響因素進(jìn)行優(yōu)化，建立回歸模型，確定最佳提取工藝。 所有試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果均為平均值，以x±s表示，數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，設(shè)置顯著性水平為P＜0.05。

1.4.4 提取次數(shù)試驗(yàn)

在最優(yōu)工藝條件提取基礎(chǔ)上，分次浸提枇杷核苦杏仁苷，依次收集提取液，直到紫外分光光度法檢測(cè)苦杏仁苷不被浸出為止，比較其提取率。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)苦杏仁苷提取量的影響

在提取溫度60℃、提取時(shí)間30min、液料比6:1和超聲波功率200W時(shí)，考察體積分?jǐn)?shù)分別為0、20%、40%、60%、80%和100%的乙醇溶液對(duì)苦杏仁苷提取量的影響。由圖1可知，苦杏仁苷的提取量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增加到80%時(shí)，提取量達(dá)到最高，隨后逐漸下降。為進(jìn)一步明確乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)苦杏仁苷提取量的影響，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)0%和80%進(jìn)行二水平試驗(yàn)。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)苦杏仁苷提取量的影響Fig.1 Effects of ethanol concentration on extraction yield of amygdalin

2.1.2 提取溫度對(duì)苦杏仁苷提取量的影響

圖2 提取溫度對(duì)苦杏仁苷提取量的影響Fig.2 Effects of temperature on extraction yield of amygdalin

在乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取時(shí)間30min、液料比6:1、超聲波功率200W時(shí)，分別考察提取溫度為30、40、50、60、70、80℃時(shí)對(duì)苦杏仁苷提取量的影響。由圖2可知，苦杏仁苷的提取量隨著提取溫度的升高而增加，當(dāng)提取溫度達(dá)到70℃后，苦杏仁苷的提取量增加趨于平緩。這可能是因?yàn)榭嘈尤受赵诶湟掖贾腥芙舛群艿?，而在熱乙醇中溶解度增大，且隨著溫度上升，溶液的黏度下降、擴(kuò)散系數(shù)增大，從而促使苦杏仁苷向提取液中擴(kuò)散[21]。為進(jìn)一步明確提取溫度對(duì)苦杏仁苷提取量的影響，選取30℃和70℃兩個(gè)溫度進(jìn)行二水平試驗(yàn)。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)苦杏仁苷提取量的影響

當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取溫度60℃、液料比6:1、超聲波功率200W，分別考察提取時(shí)間為10、20、30、40、50、60min時(shí)對(duì)苦杏仁苷提取量的影響，由圖3可知，苦杏仁苷的提取量隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到30min后，苦杏仁苷的提取量變化不明顯。為進(jìn)一步明確提取時(shí)間對(duì)苦杏仁苷提取量的影響，選取10min和40min兩個(gè)時(shí)間進(jìn)行二水平試驗(yàn)。

圖3 提取時(shí)間對(duì)苦杏仁苷提取量的影響Fig.3 Effects of extraction time on extraction yield of amygdalin

2.1.4 液料比對(duì)苦杏仁苷提取量的影響

當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取溫度60℃、提取時(shí)間30min、超聲波功率200W時(shí)，分別考察液料比為4:1、6:1、8:1、l0:1、12:1、14:1、16:1(mL/g)時(shí)對(duì)苦杏仁苷提取量的影響，由圖4可知，苦杏仁苷的提取量隨著料液比的增加而增加，當(dāng)料液比達(dá)到12:1后，苦杏仁苷的提取量增加趨于平緩。由于液料比過(guò)大，不利于后面的濃縮，在進(jìn)一步研究液料比對(duì)苦杏仁苷提取量的影響時(shí)，選取4:1和14:1兩個(gè)比例進(jìn)行二水平試驗(yàn)。

圖4 液料比對(duì)苦杏仁苷提取量的影響Fig.4 Effects of liquid/solid ratio on extraction yield of amygdalin

2.1.5 超聲波功率對(duì)苦杏仁苷提取量的影響

當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取溫度60℃、提取時(shí)間30min、液料比6:1，分別考察超聲波功率為100、150、200、250、300、350、400W時(shí)對(duì)苦杏仁苷提取量的影響。由圖5可知，苦杏仁苷的提取量隨超聲波功率的增加上升明顯，但當(dāng)超聲功率增加到300W后，苦杏仁苷的提取量略有下降。為進(jìn)一步研究超聲功率對(duì)苦杏仁苷提取量的影響，選取100W和250W兩個(gè)超聲波功率進(jìn)行二水平試驗(yàn)。

圖5 超聲波功率對(duì)苦杏仁苷提取量的影響Fig.5 Effects of ultrasonic power on extraction yield of amygdalin

2.2 二水平試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)2.1節(jié)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取每個(gè)因素里最高響應(yīng)值(用1表示)和最低響應(yīng)值(用－1表示)所對(duì)應(yīng)的因素水平，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、提取溫度(B)、提取時(shí)間(C)、液料比(D)和超聲波功率(E)對(duì)苦杏仁苷提取量的影響，進(jìn)行五因素二水平優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 二水平設(shè)計(jì)及其響應(yīng)值Table 1 Scheme and experimental results of two-level, five-factor experimental design

以苦杏仁苷提取量為響應(yīng)值，利用SPSS 16.0對(duì)表1數(shù)據(jù)進(jìn)行分析(表2)。從表2中F值的大小可以直觀地看出，上述5因素按顯著性排列是A＞D＞E＞C＞B；且A、D、E因素的F值置信度均在95%以上，而C、B兩因素的置信度卻低于95%。所以，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、液料比(D)和超聲波功率(E)這3個(gè)因素作進(jìn)一步的響應(yīng)面分析，以確定這些因素所對(duì)應(yīng)的最優(yōu)水平。由于提取時(shí)間和提取溫度決定著生產(chǎn)周期的長(zhǎng)短、能源的消耗和生產(chǎn)成本，是生產(chǎn)工藝研究中十分重要的影響因素，同時(shí)提取時(shí)間和提取溫度對(duì)苦杏仁苷提取量沒(méi)有顯著性影響，依據(jù)二水平試驗(yàn)結(jié)果，在作響應(yīng)面分析試驗(yàn)時(shí)，將提取溫度取值60℃，提取時(shí)間取值30min。

表2 二水平試驗(yàn)方差分析表Table 2 Analysis of variance for extraction yield of amygdalin

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。運(yùn)用Design-expert 7.1.3軟件對(duì)其進(jìn)行分析，建立苦杏仁苷提取量與乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)、液料比(X2)和超聲波功率(X3)3因素之間的回歸模型：

Y=38.88－1.39X1＋1.04X2－0.62X3＋0.35X1X2＋0.38X1X3－0.37X2X3－5.18X12－0.83X22－3.40X32

回歸模型的失擬性檢驗(yàn)(P=0.0826)差異不顯著，表明選用的二次回歸模型適當(dāng)。模型中P＜0.0001，表明此模型顯著。模型的校正確定系數(shù)R2Adj=99.57%，說(shuō)明試驗(yàn)測(cè)量值和預(yù)測(cè)值之間的相關(guān)性較高。由此可以確定該模型回歸效果顯著，能夠用來(lái)預(yù)測(cè)自變量和響應(yīng)值之間的關(guān)系。

表3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的方案設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Scheme and experimental results of response surface central composite design

2.3.1 回歸方程的響應(yīng)面分析

從圖6等高線圖可以看出，當(dāng)超聲波功率為250W時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比有顯著交互作用。當(dāng)提取液料比一定時(shí)，苦杏仁苷提取量隨提取乙醇體積分?jǐn)?shù)增加呈先增加后減少的趨勢(shì)，乙醇體積分?jǐn)?shù)在70%～80%的范圍時(shí)苦杏仁苷提取量較大；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)一定時(shí)，苦杏仁苷提取量隨液料比的增加而增加，當(dāng)液料比達(dá)到10:1時(shí)，提取量上升不明顯。

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比交互作用對(duì)苦杏仁苷提取量的影響Fig.6 Response surface and contour plots for interactive effects of ethanol concentration and liquid-to-solid ratio on extraction yield of amygdalin

由圖7可知，當(dāng)液料比為10:1時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲波功率的交互作用顯著影響苦杏仁苷的提取量。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)及超聲波功率的提高，苦杏仁苷提取量均呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)。乙醇體積分?jǐn)?shù)大于80%時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加苦杏仁苷提取量呈下降趨勢(shì)。這可能是隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加蛋白質(zhì)變性加快，妨礙乙醇溶液向細(xì)胞內(nèi)滲透，阻止了苦杏仁苷的溶出，從而影響了苦杏仁苷的提取量[22]。

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲波功率交互作用對(duì)苦杏仁苷提取量的影響Fig.7 Response surface and contour plots for interactive effects of ethanol concentration and ultrasonic power on extraction yield of amygdalin

圖8 液料比和超聲波功率交互作用對(duì)苦杏仁苷提取量的影響Fig.8 Response surface and contour plots for interactive effects of liquid-to-solid ratio and ultrasonic power on extraction yield of amygdalin

由圖8可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，液料比和超聲波功率的交互作用顯著影響苦杏仁苷的提取量。當(dāng)提取液料比一定時(shí)，苦杏仁苷提取量隨超聲波功率增加呈先增加后減少的趨勢(shì)。超聲波功率大于300W時(shí)，隨超聲波功率的增大，苦杏仁苷的提取量反而下降，這可能是因?yàn)槌暡üβ蔬^(guò)大時(shí)，細(xì)胞的破裂越來(lái)越完全，細(xì)胞內(nèi)大量不溶物、淀粉顆粒及黏液質(zhì)等混入提取液中，使溶液中雜質(zhì)增多，黏度增大，從而影響了苦杏仁苷的溶出[23]。

2.3.2 優(yōu)化工藝的驗(yàn)證

通過(guò)對(duì)二次回歸模型的分析，可以確定苦杏仁苷提取的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)77.64%、液料比12.53:1、超聲功率236.81W，在該工藝條件下，模型預(yù)測(cè)的苦杏仁苷提取量為39.33mg/g。為便于實(shí)際應(yīng)用，取超聲波功率取250W、乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、液料比12:1。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，苦杏仁苷的提取量為39.07mg/g，此數(shù)值與模型預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.66%，預(yù)測(cè)精度較高，說(shuō)明此模型可靠。

2.4 提取次數(shù)對(duì)苦杏仁苷提取率的影響

圖9 提取次數(shù)對(duì)苦杏仁苷提取率的影響Fig.9 Effect of extraction number on extraction yield of amygdalin

從圖9可以看出，隨著提取次數(shù)的增加，苦杏仁苷的提取率逐漸增加，提取2次的提取率達(dá)到95.74%，與傳統(tǒng)水提取工藝2次的提取率91.0%相比[4]，提取率明顯提高，并大大縮短了提取時(shí)間。此后隨著提取次數(shù)的增加，苦杏仁苷提取率的增加不明顯。因此，綜合考慮提取率和能耗等因素，提取次數(shù)以2次為宜。

3 結(jié) 論

建立了超聲波輔助提取苦杏仁苷量與乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比和超聲波功率3因素之間的多項(xiàng)回歸模型，該模型的擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，可用于苦杏仁苷提取量預(yù)測(cè)。通過(guò)單因素試驗(yàn)、二水平試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)，得到了超聲波輔助提取枇杷核苦杏仁苷的最佳條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、提取溫度60℃、提取時(shí)間30min、液料比12:1、超聲波功率250W。在此工藝條件下提取2次，苦杏仁苷提取率可達(dá)95.74%。

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Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction of Amygdalin from Loquat Seed

ZHAO Jing1，DUAN Yang-feng1，KONG Fan-yuan1，SHEN Jie1，WU Xin1，JIN Wen-yuan2，ZHENG Yong-hua1,*
(1. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China；2. Suzhou Full Fortune Food Co. Ltd., Suzhou 215111, China)

Ultrasonic was used to help extract amygdalin from loquat seed with ethanol aqueous solution. To optimize the extraction process, the effects of operation parameters such as ethanol concentration, temperature, extraction time, liquid-tosolid ratio and ultrasonic power on extraction efficiency were investigated by single-factor experiments. Based on this, a twolevel, five-factor experimental design was used to investigate the affecting significance of the operation parameters, and a quadratic model for extraction efficiency as a function of ethanol concentration, liquid-to-solid ratio and ultrasonic power that were determined to be main affecting variables was established using central composite design, and the optimization of the three operation parameters were performed using response surface methodology. Ethanol concentration of 75%, temperature of 60 ℃,extraction duration of 30 min, liquid-to-solid ratio of 12:1(mL/g) and ultrasonic power of 250 W were found optimum and the extraction efficient was observed to be 39.07 mg/g, with the relative error being 0.66% compared to the predicted value. Thus,the established model for extraction efficiency had high prediction accuracy.

loquat seed；amygdalin；ultrasonic-assisted extraction；optimization；response surface methodology

TS201.1

A

1002-6630(2011)08-0037-06

2010-11-17

國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201003073)

趙靜(1985—)，女，碩士研究生，主要從事農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工研究。E-mail：jiangsuzhaojing@126.com

*通信作者：鄭永華(1963—)，男，教授，博士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工研究。E-mail：zhengyh@njau.edu.cn