王相友，王 健，朱繼英，趙 亞

(山東理工大學(xué)農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院，山東 淄博 255049)

雙孢蘑菇酶促褐變特性及褐變的控制

王相友，王 健，朱繼英，趙 亞

(山東理工大學(xué)農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院，山東 淄博 255049)

為有效控制雙孢蘑菇褐變，研究pH值、溫度、底物濃度以及抑制劑對雙孢蘑菇的多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)活性的影響。結(jié)果表明：以鄰苯二酚為底物，雙孢蘑菇PPO最適反應(yīng)pH6.8，最適反應(yīng)溫度20℃，最適反應(yīng)底物濃度為0.06mol/L，米氏常數(shù)Km為0.1072mol/L。采用計算機圖像處理技術(shù)對雙孢蘑菇褐變程度進行定量檢測，得出對雙孢蘑菇貯藏保鮮效果較好的褐變抑制劑及其最佳配比為0.30mmol/L半胱氨酸、0.06%抗壞血酸、0.05%乙酸。

雙孢蘑菇；多酚氧化酶；褐變控制；計算機圖像處理

雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)是世界性栽培的重要食用真菌。其味道鮮美，營養(yǎng)價值高[1]，最近幾年是我國出口量最大的食用菌之一[2-4]。但是雙孢蘑菇在貯藏過程中容易發(fā)生褐變，導(dǎo)致其商品品質(zhì)和可銷售性降低，主要原因是雙孢蘑菇組織中的多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)催化酚類物質(zhì)氧化成醌[5-6]。目前測定褐變程度一般應(yīng)用色差計，其缺點是需要大塊平整的表面，破壞菇體。通過分光光度計測PPO的吸光度[7-8]對雙孢蘑菇的色澤或褐變度做出評價，對實驗條件和設(shè)備要求較高，PPO易失活，不利于實際生產(chǎn)的推廣和應(yīng)用。用計算機圖像處理技術(shù)快速無損檢測雙孢蘑菇色澤和褐變度尚未見報道。褐變控制的方法主要有低溫冷藏法、亞硫酸鈉浸泡保鮮法、氣調(diào)貯藏法和射線輻射處理等，但卻存在著食品安全性、成本以及防褐變效果等問題[9-11]。Beaulieu等[12]研究表明用γ射線輻射處理后的雙孢蘑菇PPO活性降低，貯藏期延長。李霞等[10]研究表明初始氣體體積分數(shù)為15% O2、10% CO2，0.06mm厚PVC包裝、2℃貯藏能明顯抑制雙孢蘑菇的褐變。抑制劑對雙孢蘑菇PPO活性的影響已有較多研究，但多采用亞硫酸鈉或焦亞硫酸鈉的含硫化合物[13-14]，對身體的危害，現(xiàn)已限制使用。

本實驗以鄰苯二酚為底物，測定了pH值、底物濃度和溫度對雙孢蘑菇PPO活性的影響，并采用計算機無損檢測法，用高倍像素相機取得圖像，導(dǎo)入計算機分析，對色澤變化定量測定。研究不含硫抑制劑對雙孢蘑菇褐變的影響，為保證食品安全，延長貨價期，獲得較高的市場價值提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雙孢蘑菇采自山東省淄博市淄川區(qū)淄河鎮(zhèn)東石門村；鄰苯二酚(分析純) 天津瑞金特公司；檸檬酸，檸檬酸鈉(分析純) 天津化學(xué)試劑三廠；醋酸鈉(分析純)上海聯(lián)試公司；冰乙酸(分析純) 萊陽精細化工廠；硼酸(分析純) 萊陽康德公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉(分析純) 江蘇強盛公司；抗壞血酸(VC，分析純) 天津博迪公司；L-半胱氨酸(分析純) 天津科密歐開發(fā)中心。

1.2 儀器與設(shè)備

移液槍 上海艾晟特公司；UV-2550分光光度計 日本島津公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 龍口先科公司；電子天平、UB-7酸度計 北京Denver公司。

1.3 方法

1.3.1 PPO粗酶液的制備

每個處理從3個雙孢蘑菇上取20.0g，經(jīng)液氮速凍后放入在-35℃預(yù)冷的研缽中充分研磨，解凍后加40mL抽提緩沖液[0.05mol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH6.8)，3% Triton X-100(V/V)，0.25g/L PVP，0.03g/L聚乙二醇M6000]，并加適量石英砂冰浴繼續(xù)研磨10min；0℃、8500r/min離心20min，取上清液得粗酶液。

1.3.2 PPO活性測定

按Zauberman等[15]方法測定，略有改動。在1cm比色皿中加入1.95mL pH6.8抽提緩沖液，再加入0.1mol/L鄰苯二酚溶液1.0mL，迅速加入PPO粗酶液0.05mL，混勻。室溫(18℃)在450nm波長處測定吸光度，實驗重復(fù)3次。以每分鐘內(nèi)吸光度變化0.001為1個酶活力單位(U)。

1.3.3 pH值對PPO活性的影響及PPO最適pH值的測定

配制0.05mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液(pH3.0、3.5)，醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH4.0、4.5、5.0、5.5)，磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液(pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)，硼酸-氫氧化鈉緩沖溶液(pH8.5、9.0、9.5、10.0)，測定PPO活性。實驗重復(fù)3次。根據(jù)確定的PPO最適pH值的范圍，配制濃度為0.05mol/L，pH值梯度為0.1的緩沖溶液，測定出雙孢蘑菇最適反應(yīng)p H值。

1.3.4 底物濃度與PPO活性的關(guān)系

用1.3.3節(jié)測定出的雙孢蘑菇PPO最適pH值的緩沖溶液，配置濃度為0.01～0.10mol/L，梯度為0.01的鄰苯二酚作為底物，在1cm比色皿中，加2.95mL不同濃度的鄰苯二酚溶液，0.05mL PPO粗酶液。在室溫測定PPO的活性，每個底物濃度重復(fù)3次。根據(jù)Lineweaver-Burk作圖法[17]得米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速率Vmax值。

1.3.5 溫度對PPO活性的影響

在1cm比色皿中，加入濃度為0.05mol/L，雙孢蘑菇PPO最適pH值下的緩沖溶液1.95mL，0.10mol/L的鄰苯二酚溶液1.0mL。在5～50℃(間隔5℃一個處理)保溫10min，加入相同溫度保溫10min的PPO粗酶液0.05mL。在10s和70s，測定OD450值。每個溫度重復(fù)3次。

1.3.6 抑制劑對PPO活性及褐變的影響

1.3.6.1 抑制劑對PPO活性的影響

表1 單抑制劑對雙孢蘑菇PPO活性影響的實驗方案Table 1 Experimental protocol for investigating the effects of single inhibitors on PPO) activity from Agaricus bisporus

1.3.6.2 抑制劑對雙孢蘑菇褐變的影響

根據(jù)單因素試驗，篩選出效果明顯的抑制劑，進行正交試驗處理，清水浸泡處理作為對照組(CK)，浸泡時間為5min，雙孢蘑菇的體積與其浸泡液的體積比為1:3。室溫貯藏，以褐變度作為評判指標，應(yīng)用計算機圖像處理技術(shù)對褐變度進行檢測，篩選適宜的褐變抑制劑配比。

在固定的光照強度下，使用高倍照相機Sony DSCHX1(像素910萬)捕捉雙孢蘑菇彩色圖像，導(dǎo)入電腦用Photoshop軟件進行分析，得出紅(R)、綠(G)、藍(B)；并繼續(xù)在室溫下放置3d，每隔12h測定RGB值。根據(jù)RGB與H值之間的換算公式[18]將RGB值換算成H值。同一圖像不同時間H值之間的差值反映出雙孢蘑菇褐變的程度。

H值變化率/%＝(0h時H值－72h時H值)/0h時H值×100

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值對PPO活性的影響及PPO活性最適pH值范圍確定

2.1.1 pH值對PPO活性的影響

由圖1可知，pH6.5和pH8.5處分別出現(xiàn)一個峰值，說明雙孢蘑菇PPO可能含有至少兩種同工酶。在pH＜5.5或pH＞9.0時，PPO催化活性顯著下降。這是因為PPO含Cu2+，在pH值低于3.0的酸性環(huán)境中，Cu2+被解離出來，使酶失活；而在強堿條件下，Cu2+與溶液中的OH-反應(yīng)生成氫氧化銅，從而使酶活性顯著降低[16]。因此，通過調(diào)節(jié)pH值可有效抑制雙孢蘑菇PPO活性。

圖1 pH值對雙孢蘑菇 PPO相對活性的影響Fig.1 Effect of pH on PPO activity from Agaricus bisporus

2.1.2 PPO相對活性最適pH值的測定

據(jù)2.1.1節(jié)確定的最大峰值得出pH值范圍，配制pH6.0～7.0，梯度為0.1；濃度均為0.05mol/L的磷酸鹽緩沖溶液，測定PPO相對活性。實驗重復(fù)3次。測定結(jié)果見圖2。

圖2 雙孢蘑菇PPO相對活性最適pH值范圍Fig.2 Determination of optimal pH for PPO activity from Agaricus bisporus

由圖2可知，曲線在pH6.8處出現(xiàn)峰值，雙孢蘑菇PPO相對活性的最適pH值為6.8，該結(jié)果與趙東海等[19]的研究結(jié)果基本一致。朱梅等[20]的研究表明，金針菇PPO相對活性最適pH值是6.0；宋蓮軍等[21]認為PPO相對活性的最適pH值為5.4?？梢?，pH值是影響PPO相對活性的重要因素，不同生物體內(nèi)PPO相對活性的最適pH值有較大差異。

2.2 底物濃度與雙孢蘑菇PPO活性的關(guān)系

以鄰苯二酚為反應(yīng)底物，不同的底物濃度([S])對應(yīng)的酶活性見圖3。鄰苯二酚濃度較低時，增加鄰苯二酚濃度，酶活性相應(yīng)增強；但當(dāng)鄰苯二酚濃度達到0.06mol/L時，即使再增加鄰苯二酚濃度，酶的活力也不再增強，而是趨于不變。根據(jù)H e n r i的解釋和Michaelis-Menten方程，當(dāng)?shù)孜镟彵蕉拥臐舛萚S]≤0.06mol/L時，酶促反應(yīng)速度v與[S]成正比關(guān)系，反應(yīng)顯示為一級動力學(xué)特征；當(dāng)[S]＞0.06mol/L時，隨著[S]的增大，v不再上升，即v與[S]已脫離關(guān)系，反應(yīng)顯示為零級動力學(xué)特征，這時v趨向于最大值Vmax。由此得出雙孢蘑菇PPO活性最適反應(yīng)底物濃度為0.06mol/L，并且底物濃度與PPO活性的關(guān)系遵循Michaelis-Menten的酶促動力學(xué)。

圖3 底物濃度與雙孢蘑菇 PPO活性的關(guān)系Fig.3 Effect of substance concentration on PPO activity from Agaricus bisporus

根據(jù) Lineweaver-Burk作圖法，以1/[S]為橫坐標，1/v為縱坐標作圖，見圖4，求得米氏常數(shù)Km＝0.1072mol/L，最大反應(yīng)速率Vmax＝0.0239U/min。

圖4 雙孢蘑菇PPO的米氏常數(shù)的確定Fig.4 Determination of PPO Michaelis constant

2.3 溫度對雙孢蘑菇PPO相對活性的影響

如圖5所示，PPO相對活性先隨溫度升高而上升，在20℃時達到最大值100%，而后又隨溫度的升高而下降；在低于10℃、高于30℃時，PPO相對活性較?。环磻?yīng)溫度為50℃時PPO已經(jīng)基本不表現(xiàn)出活性。原因是雙孢蘑菇PPO在最適溫度才能被完全激活，而高溫使PPO變性。因此，雙孢蘑菇PPO是一種不耐高溫，對熱不穩(wěn)定的酶類，它的最適反應(yīng)溫度是20℃，可采用低溫貯藏來抑制雙孢蘑菇PPO活性，延緩褐變。

圖5 溫度對雙孢蘑菇PPO相對活性的影響Fig.5 Effect of temperature on PPO activity from Agaricus bisporus

溫度對雙孢蘑菇PPO相對活性的影響表現(xiàn)在隨溫度的升高，酶活性因被激活先升高，而后又因酶蛋白被鈍化，活性降低。不同種類果蔬的PPO最適反應(yīng)溫度表現(xiàn)不一致：王向陽等[16]的研究結(jié)果表明蓮藕的最適反應(yīng)溫度為35℃；付聿成等[22]認為金帥蘋果的最適反應(yīng)溫度為40℃。

2.4 單抑制劑對雙孢蘑菇PPO活性的抑制作用

表2 雙孢蘑菇PPO抑制劑單因素試驗結(jié)果Table 2 Effect of single inhibitors at various concentrations on PPO activity from Agaricus bisporus

由表2所示，不同褐變抑制劑對雙孢蘑菇PPO抑制效果有較大差別。除氯化鈉外，其他4種抑制劑溶液的pH值均在2～5范圍內(nèi)，能顯著降低體系中pH值。L-半胱氨酸能在低濃度下對PPO起到強烈抑制作用，其機理是能與醌類物質(zhì)發(fā)生加成反應(yīng)，生成無色穩(wěn)定的化合物，阻止黑色素的形成，并可與體系中的氧發(fā)生氧化還原反應(yīng)進而有效抑制褐變；抗壞血酸、乙酸也具有較強的抑制作用，抗壞血酸的作用機理是作為還原劑，將體系中生成的醌類物質(zhì)及其衍生物還原成酚類物質(zhì)，并降低體系中的含氧量[19]；乙酸作用機理還需進一步研究；檸檬酸和氯化鈉的抑制作用較弱，檸檬酸在雙孢蘑菇表面形成一層黃色膜，影響了商品品質(zhì)，其作用機理還有待研究。

2.5 雙孢蘑菇褐變的控制

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選用半胱氨酸、抗壞血酸，乙酸為試驗因素，以雙孢蘑菇貯藏后第72小時的褐變度作評判指標，進行L9(34)正交試驗。正交試驗因素與水平及結(jié)果見表3，方差分析見表4所示。

表 3 抑制劑對雙孢蘑菇褐變度影響的正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Orthogonal array design and corresponding experimental results for optimizing inhibition of Agaricus bisporus browning by combined use of three inhibitors

表4 抑制劑對雙孢蘑菇褐變度的影響試驗結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of browning degree of Agaricus bisporus with various amounts of three inhibitors

由表3、4數(shù)據(jù)分析表明：A因素對雙孢蘑菇褐變度有顯著影響(P＜0.05)，B、C因素對雙孢蘑菇褐變度無顯著影響(P＞0.05)，因此，最適合抑制劑組合為A2B1C1。

3 結(jié) 論

3.1 PPO催化的酶促反應(yīng)時引起雙孢蘑菇褐變的主要原因。雙孢蘑菇PPO反應(yīng)的最適pH值為6.8，最適溫度是20℃。以鄰苯二酚為底物時，最適底物濃度為0.06mol/L。

3.2L-半胱氨酸能在低濃度下對雙孢蘑菇PPO起到強烈抑制作用，抗壞血酸、醋酸也具有極強的抑制作用，檸檬酸和氯化鈉的抑制作用較弱。

3.3 防止雙孢蘑菇褐變的最佳保鮮劑組合是：0.30mmol/L半胱氨酸、0.06%抗壞血酸、0.05%乙酸。

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Enzymatic Browning Characteristics and Control of Button Mushroom (Agaricus bisporus)

WANG Xiang-you，WANG Jian，ZHU Ji-ying，ZHAO Ya
(School of Agricultural Engineering and Food Science, Shandong University of Technology, Zibo 255049, China)

In order to effectively inhibit enzymatic browning inAgaricus bisporus, effects of pH values, temperature, substrate concentration and inhibitors on polyphenol oxidase (PPO) activity fromAgaricus bisporuswere studied. The results showed that the optimum pH value and temperature for PPO activity fromAgaricus bisporuswere 6.8 and 15－20℃ using pyrocatechol as substrate. The Michaelis constant of PPO wasKm = 0.1072 mol/L. Computational imaging analysis showed that mixture of 0.30 mmol/L sodium sulfite, 0.06% ascorbic acid and 0.05% acetic acid had effective inhibition on enzymatic browning inAgaricus bisporus.

Agaricus bisporus；polyphenol oxidase；enzymatic browning；computational imaging analysis

S646.11

A

1002-6630(2011)20-0318-05

2010-12-19

國家自然科學(xué)基金項目面上項目(30871757)；國家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目(2010GB2C600253)

王相友(1961—)，男，教授，博士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏研究。E-mail：wxy@sdu.edu.cn