鄭衛(wèi)東，胡江濤，陰文婭*，盛 毅，武志雄

(1.四川省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢測(cè)院，四川 成都 610031；2.四川出入境檢驗(yàn)檢疫局，四川 成都 610041；3.四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室，四川 成都 610041)

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定豬肝中阿維菌素、伊維菌素殘留

鄭衛(wèi)東1，胡江濤2，陰文婭3,*，盛 毅2，武志雄3

(1.四川省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢測(cè)院，四川 成都 610031；2.四川出入境檢驗(yàn)檢疫局，四川 成都 610041；3.四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室，四川 成都 610041)

目的：建立高效液相色譜-四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(LC-MS/MS)同時(shí)測(cè)定豬肝臟中阿維菌素(AVM)和伊維菌素(IVM)的殘留量。方法：豬肝樣品均質(zhì)后用乙腈提取，堿性氧化鋁固相萃取柱(SPE)凈化，采用串聯(lián)質(zhì)譜電噴霧電離ESI(+)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)檢測(cè)，以保留時(shí)間和子離子比定性，外標(biāo)法定量。結(jié)果：方法檢出限(LOD)均為2.0μg/kg，定量限(LOQ)為5.0μg/L，兩種藥物的線(xiàn)性范圍均為5～100μg/L，相關(guān)系數(shù)均為0.9999。添加水平在2～20μg/kg范圍內(nèi)，阿維菌素和伊維菌素的平均回收率分別為77.0%～83.3%和76.9%～79.8%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別小于12.1%和13.0%。結(jié)論：方法操作簡(jiǎn)單，靈敏準(zhǔn)確，可滿(mǎn)足當(dāng)前國(guó)內(nèi)外該產(chǎn)品中此類(lèi)藥物的檢測(cè)要求。

豬肝；阿維菌素；伊維菌素；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

阿維菌素(a v e r m e c t i n，A V M)和伊維菌素(ivermectin，IVM)[1-2]是由阿維鏈霉菌產(chǎn)生的一組廣譜、高效、安全的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗寄生蟲(chóng)藥，對(duì)體內(nèi)外寄生蟲(chóng)特別是線(xiàn)蟲(chóng)和節(jié)肢動(dòng)物均有良好的驅(qū)殺作用，國(guó)內(nèi)外在豬、牛、羊等家畜中使用廣泛。AVMs主要分布于動(dòng)物肝臟和脂肪組織中，且在動(dòng)物體內(nèi)殘留時(shí)間長(zhǎng)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)阿維菌素具有生殖毒性，長(zhǎng)期暴露可能對(duì)人體具有嚴(yán)重健康損害危險(xiǎn)，且對(duì)水生環(huán)境有劇毒性。各國(guó)都制定了阿維菌素最高殘留限量(MRLs)[3-5]。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，目前阿維菌素的檢測(cè)方法[6-13]主要有高效液相色譜法(HPLC)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)、液質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)等。已有方法主要是對(duì)藥物制劑含量、植物、牛肉及尿液中阿維菌素殘留量的測(cè)定。最新頒布的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)阿維菌素類(lèi)藥物殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法也僅適用牛肉及牛肝[14]，還沒(méi)有針對(duì)豬肝的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。豬肝基質(zhì)復(fù)雜，常規(guī)的檢測(cè)方法易出現(xiàn)假陽(yáng)性、色譜峰易受雜質(zhì)干擾，因此對(duì)前處理要求也較高。本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜-電噴霧四極桿串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定豬肝中的阿維菌素和伊維菌素，并對(duì)提取溶劑、凈化方法以及測(cè)定技術(shù)進(jìn)行研究，方法操作簡(jiǎn)便，定性定量準(zhǔn)確，靈敏度等各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)滿(mǎn)足殘留檢測(cè)的要求，以期為阿維菌素和伊維菌素的檢測(cè)研究提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬肝組織，攪碎混勻。

標(biāo)準(zhǔn)品阿維菌素(純度≥96%)、伊維菌素(純度≥98%) 德國(guó)Augsburg公司；乙腈、正己烷、乙酸、乙酸銨(均為色譜純) 美國(guó)Tedia公司；無(wú)水硫酸鈉(分析純，650℃灼燒4h，貯藏于干燥器中備用)；氯化鈉(分析純，400℃灼燒2h，貯藏于干燥器中備用)。

1.2 儀器與設(shè)備

ABI4000高效液相色譜-三重四極質(zhì)譜聯(lián)用儀(配有電噴霧離子源) 美國(guó)ABI公司；IKA-WERKE型高速組織勻漿機(jī) 德國(guó)IKA公司；B8500S-DTH超聲波清洗器上海必能信超聲有限公司；LG10-2.4A離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠(chǎng)；Anpelclea堿性氧化鋁SPE柱(6mL，1000mg，使用前用10mL乙腈活化) 上海安譜科學(xué)儀器有限公司；水浴氮吹儀。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

乙腈飽和的正已烷：取50mL乙腈加入到1000mL正已烷中，充分混勻，分層后取正已烷層備用。

阿維菌素和伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取適量標(biāo)準(zhǔn)品(精確至0.1mg)，用乙腈配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置－18℃冰箱中避光保存。

空白樣品提取液：準(zhǔn)確稱(chēng)取20g空白豬肝臟組織，加入100mL乙腈，樣品的前處理提取后合并提取液用足量無(wú)水硫酸鈉脫水，再用20mL乙腈飽和正已烷除脂，備用。

1.3.2 色譜與質(zhì)譜條件

Pickering laboratories C8柱(150mm×4.6mm，5μ m)；柱溫：25℃；流動(dòng)相：乙腈:(0.1%乙酸-5mmol/L乙酸銨)=90:10(V/V)；等度洗脫；流速：0.6mL/min；進(jìn)樣量：2 0μL。

電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。高純氮?dú)鉃檩d氣、碰撞氣和氣簾氣，電噴霧電壓(IS)＋5500V，去簇電壓(DP)12V，霧化氣壓力(GAS1)30psi，氣簾氣壓力(CUR)20psi，輔助氣壓力(GAS2)40psi，離子源溫度(TEM)400℃，駐留時(shí)間300ms。

1.3.3 樣品的前處理

提取：稱(chēng)取5.0g勻漿后的新鮮豬肝臟組織至50mL離心管中，加5g無(wú)水硫酸鈉、1g氯化鈉和20mL乙腈，高速勻漿2min，超聲30min，4000r/min離心10min。取上清液至容量瓶，殘?jiān)謩e用15、10mL乙腈重復(fù)提取離心兩次，合并上清液，用乙腈定容至50mL，待凈化。

凈化：取提取液25mL過(guò)堿性氧化鋁小柱(已活化)，之后用4mL乙腈淋洗，收集全部流出液，控制流出液的速度低于1.0mL/min。再經(jīng)無(wú)水硫酸鈉脫水后，在50℃水浴下用氮?dú)獯抵两桑?.0 mL流動(dòng)相溶解殘?jiān)?，過(guò)有機(jī)微孔濾膜(0.22μm)后，供LC-MS/MS測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)選用廣泛使用的ESI作為離子源，[M+NH4]+離子為兩待測(cè)物的母離子，在流動(dòng)相中加乙酸和乙酸銨以增強(qiáng)待測(cè)物的離子化。對(duì)AVM和IVM混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(1mg/L)在正離子模式下對(duì)母離子進(jìn)行全掃描，找出AVM和IVM的[M+NH4]+峰，以該分子離子峰對(duì)離子源參數(shù)(IS、GAS1、GAS2、CUR、TEM等)進(jìn)行優(yōu)化，使儀器靈敏度達(dá)到最高。再對(duì)子離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜全掃描，選取二級(jí)質(zhì)譜中沒(méi)有干擾、信號(hào)相對(duì)較強(qiáng)的2個(gè)特征碎片離子，與其母離子組成兩對(duì)離子對(duì)，對(duì)該藥物進(jìn)行定性和定量分析。AVM和IVM的母離子/子離子及碰撞能量見(jiàn)表1，提取離子色譜圖見(jiàn)圖1。

表1 AVM和IVM的母離子、子離子及碰撞能量Table 1 Parent and daughter ions and collision energy of avermectin and ivermectin

圖1 AVM和IVM的提取離子色譜圖(添加水平10μg/L)Fig.1 Ion chromatograms of avermectin and ivermectin standards

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

阿維菌素類(lèi)藥物是一類(lèi)相對(duì)分子質(zhì)量較高的弱極性化合物，選用反相高效液相色譜進(jìn)行分離較合適。本實(shí)驗(yàn)對(duì)C8和C18兩種色譜柱進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：阿維菌素和伊維菌素在C18柱上出峰太快，不能完全和雜質(zhì)分開(kāi)，且響應(yīng)強(qiáng)度較低；而其在C8柱上則能完全與雜質(zhì)分離，且峰型更尖銳，響應(yīng)強(qiáng)度也較C18上的大得多。進(jìn)一步比較3個(gè)品牌的C8色譜柱，發(fā)現(xiàn)不同廠(chǎng)家的C8柱間存在著差別，最終選定產(chǎn)生峰形和響應(yīng)強(qiáng)度最好的Carbamate Analysis C8(150mm×4.6mm，5μm)為實(shí)驗(yàn)所用色譜柱。

2.2.2 流速和柱溫的選擇

本實(shí)驗(yàn)比較0.2、0.4、0.5、0.6、0.7mL/min流速時(shí)，待測(cè)物的峰型和響應(yīng)強(qiáng)度等指標(biāo)，結(jié)果顯示流速加大，待測(cè)物的響應(yīng)有一定增加，增大質(zhì)譜霧化氣流速后，質(zhì)譜的響應(yīng)強(qiáng)度趨于穩(wěn)定，最終確定0.6mL/min為理想流速。實(shí)驗(yàn)表明柱溫對(duì)兩種化合物的分離基本沒(méi)有顯影響，考慮室溫，選定柱溫為2 5℃。

2.2.3 流動(dòng)相的選擇

圖2 空白豬肝臟組織的色譜圖Fig.2 Chromatogram of blank pork liver tissue

本實(shí)驗(yàn)選用ESI正離子模式，[M+NH4]+離子為母離子，在流動(dòng)相中加入5mmol/L乙酸銨可促進(jìn)母離子的形成，同時(shí)加入0.1%乙酸來(lái)增強(qiáng)待測(cè)物的離子化。比較甲醇和乙腈，結(jié)果顯示甲醇作流動(dòng)相時(shí)，兩待測(cè)物的峰形延展較寬，響應(yīng)強(qiáng)度較低，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)同物質(zhì)的雙峰現(xiàn)象；乙腈作流動(dòng)相時(shí)，兩物質(zhì)出峰的峰型和響應(yīng)強(qiáng)度均比甲醇好，特別是伊維菌素的響應(yīng)有成倍的增強(qiáng)，最終選擇乙腈:緩沖液(0.1%乙酸-5mmol/L乙酸銨)=90:10(V/V)為流動(dòng)相。在所選的最佳儀器條件下，空白豬肝臟組織及其加混標(biāo)10μg/kg阿維菌素和伊維菌素的色譜圖分別見(jiàn)圖2、3。

圖3 空白豬肝臟組織添加10μg/kg標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig. 3 Chromatogram of blank swine liver tissue spiked at 10μg/kg

2.3 樣品處理?xiàng)l件的選擇及優(yōu)化

2.3.1 提取條件的選擇

參考國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)資料，大多選用乙腈作為樣品提取溶劑。乙腈與水任一比混溶，很容易滲透到組織內(nèi)部，提取效率高，且乙腈本身對(duì)樣品中的糖、脂肪和蛋白質(zhì)的溶解性較小，對(duì)蛋白又有沉淀作用，所以實(shí)驗(yàn)選用乙腈作為提取溶劑。

2.3.2 凈化方法的選擇

常用的凈化方法有乙腈飽和的正己烷液-液萃取法和C18柱、中性氧化鋁柱、堿性氧化鋁柱固相萃取法。本實(shí)驗(yàn)比較幾種凈化方法的去脂效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：乙腈飽和的正己烷、C18及中性氧化鋁小柱的去脂效果均不甚理想，且回收率在60%以下，而堿性氧化鋁小柱不僅去脂效果好，而且回收率也高，可達(dá)80%，完全能滿(mǎn)足方法要求，所以本實(shí)驗(yàn)確定用堿性氧化鋁柱凈化。

同時(shí)進(jìn)行堿性氧化鋁柱洗脫效率的實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證小柱對(duì)阿維菌素和伊維菌素的吸留作用。實(shí)驗(yàn)表明：樣品提取液過(guò)柱后，固相萃取柱再用2mL乙腈即可將殘留的阿維菌素和伊維菌素完全洗脫，過(guò)量的洗脫液可能將小柱吸附的雜質(zhì)洗脫，綜合考慮采用4mL乙腈來(lái)洗脫柱內(nèi)吸留待測(cè)物。

2.4 方法線(xiàn)性方程和檢出限

實(shí)驗(yàn)比較乙腈和空白樣品提取液作為標(biāo)準(zhǔn)的稀釋液配制標(biāo)準(zhǔn)系列，發(fā)現(xiàn)豬肝臟樣中存在著基質(zhì)減弱效應(yīng)，使得阿維菌素和伊維菌素的儀器響應(yīng)不理想，回收率偏低；本實(shí)驗(yàn)用空白豬肝樣品提取液配制標(biāo)準(zhǔn)，以補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)[15]吸取標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用陰性豬肝臟組織的空白提取液稀釋成0.005、0.010、0.020、0.050、0.100mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.2節(jié)的儀器條件進(jìn)行測(cè)定。用選定的定量離子峰面積(Y)對(duì)質(zhì)量濃度(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得線(xiàn)性方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。

表2 阿維菌素和伊維菌素的線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)Table 2 Linear equations and correlation coefficients for the determination of avermectin and ivermectin

以10倍信噪比所對(duì)應(yīng)的待測(cè)物質(zhì)量濃度為最低定量質(zhì)量濃度，根據(jù)樣品的濃縮倍數(shù)，確定本方法定量限為5.0μg/L，樣品定量限為2.0μg/kg，線(xiàn)性范圍是5～100μg/L，在線(xiàn)性范圍以外時(shí)，可適當(dāng)增大樣品最終定容體積或減小樣品凈化體積。

2.5 方法回收率和精密度

2.5.1 方法回收率

選取不含阿維菌素和伊維菌素本底的豬肝臟組織樣品，進(jìn)行不同添加水平的阿維菌素和伊維菌素加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，添加水平為2、10、20μg/kg三個(gè)添加水平，每個(gè)質(zhì)量濃度做10個(gè)平行樣，阿維菌素樣品添加平均回收率在77.0%～83.3%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在8.6%～12.1%之間；伊維菌素樣品添加平均回收率在76.9%～79.8%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在9.9%～13.0%之間?；厥章蕽M(mǎn)足要求?；厥章式Y(jié)果見(jiàn)表3。

表3 阿維菌素和伊維菌素加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)(n=10)Table 3 Spike recovery rates for avermectin and ivermectin

2.5.2 方法精密度

表4 阿維菌素精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=10)Table 4 Precision of this method in avermectin determinationμg/kg

表5 伊維菌素精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=10)Table 5 Precision of this method in ivermectin determinationμg/kg

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立豬肝臟組織中阿維菌素類(lèi)藥物殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，其前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，靈敏度高，準(zhǔn)確度、精密度和各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)均滿(mǎn)足國(guó)內(nèi)外殘留檢測(cè)的相關(guān)要求，可用于豬肝臟組織中阿維菌素類(lèi)藥物殘留的檢測(cè)。

[1] SAMSONOVA J V, BAXTER G A, CROOKS S R, et al. Determination of ivermectin in bovine liver by optical immunobiosensor[J].Biosensors and Bioelectronics, 2002, 17(6/7): 523-529.

[2] DANAHERK M, HOWELLS L C, CROOKS S R, et al. Review of methodology for the determination of macrocyclic lactone residues in biological matrices[J]. Journal of Chromatography B, 2006, 844(2):175-203.

[3] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào). 動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量[S]. 2002.

[4] Official Journal of the European Union. EU Pesticides database[EB/OL].(2010-11-10). http://ec.europa.eu/sanco_pesticides/public/index.cfm.

[5] FAO/WHO Food standards codex alimentarius. Pesticide residues in food[EB/OL]. (2010-07). http://www.codexalimentarius.net/mrls/pestdes/jsp/pest_q-e.jsp.

[6] DANAHERK M, OKEFFE M, GLENNON J D. Validation and robustness testing of a HPLC method for the determination of avermectins and moxidectin in animal liver samples using an alumina column clean-up[J]. Analyst, 2000, 125(10): 1741-1744.

[7] TURNIPSEED S B, ROYBAL J E, RUPP H S, et al. Confirmation of avermectin residues in food matrices with negative-ion atmospheric pressure chemical ionization liquid chromatography/mass spectrometry[J].Rapid Communications In Mass Spectrometry, 1999, 13(6): 493-499.

[8] 張啟迪, 鄒明, 劉文華, 等. 阿維菌素殘留檢測(cè)中不同SPE柱凈化效果的比較研究[J]. 中國(guó)動(dòng)物檢疫, 2007, 24(12): 29-30.

[9] WANG Jian. Analysis of macrolide antibiotics, using liquid chromatography-mass spectrometry, in food, biological and environmental matrices[J]. Mass Spectrom Rev, 2009, 28(1): 50-92.

[10] RUDIK I, CUMMINGS M R, POPPENGA R H. Isolation and multiresidue detection of macrolide endectocides present in animal matrices[J]. J Vet Diagn Invest, 2002,14(4): 295-302.

[11] 趙東豪, 賀利民, 聶建榮, 等. 豬肉組織中阿維菌素類(lèi)藥物殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào), 2008, 27(8): 862-865.

[12] HEERNANDO M D, SUAREZ-BARCENA J M, BUENO M J, et al.Fast separation liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the confirmation and quantitative analysis of avermectin residues in food[J]. Journal of Chromatography A, 2007, 1155(1): 62-73.

[13] HOU Xiaolin, LI Xiaowei, DING Shuangyang, et al. Simultaneous analysis of avermectins in bovine tissues by LC-MS-MS with immunoaffnity chromatography[J]. Chromatographia, 2006, 63(11/12): 543-550.

[14] GB/T 21320—2007動(dòng)物源食品中阿維菌素類(lèi)藥物殘留量的測(cè)定: 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[S].

[15] HERNANDEZ F, SANCHO J V, POZO J. Critical review of the application of liquid chromatography/mass spectrometry to the determination of pesticide residues in biological samples[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2005, 382(4): 934-946.

Determination of Avermectin and Ivermectin Residues in Pork Liver by High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

ZHENG Wei-dong1，HU Jiang-tao2，YIN Wen-ya3,*，SHENG Yi2，WU Zhi-xiong3
(1. Sichuan Institute of Product Quality Supervision and Inspection, Chengdu 610031, China；
2. Sichuan Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Chengdu 610041, China；
3. Department of Nutrition and Food Hygiene, West China School of Public Health, Sichuan University, Chengdu 610041, China)

Objective: To establish a method for the simultaneous determination of avermectin and ivermectin residues in pork liver using high performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS).Methods: Avermectin and ivermectin residues were extracted with acetonitrile, cleaned up on a solid phase extraction (SPE)column containing alkaline aluminum oxide, separated on a C8 column, detected by tandem mass spectrometry with electrospray ionization and multiple reaction monitoring interface and quantitatively determined by high performance liquid chromatography in an external standard manner. Results: The limits of detection (LOD) for avermectin and ivermectin were 2μg/kg and limits of quantitation were 5μg/L. Both the linear ranges of avermectin and ivermectin were 5－100μg/L with correlation coefficients of both 0.9999. The recovery rate range of this method was 77.0%－83.3% for avermectin and 76.9%－79.8% for ivermectin with relative standard deviations (RSD) of 8.6%－12.1% and 9.9%－13.0% at spike levels of 2, 10μg/kg and 20μg/kg,respectively. Conclusion: This method is simple, sensitive and accurate, which can meet the domestic and international requirements for the detection of both veterinary drugs.

pork liver；avermectin；ivermectin；high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

R155.5

A

1002-6630(2011)04-0185-04

2010-03-11

四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(04JY029-033)

鄭衛(wèi)東(1964—)，男，教授級(jí)高級(jí)工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称贩治?。E-mail：axlzwd2004@126.com

*通信作者：陰文婭(1972—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)。E-mail：yinwenya@126.com