俞彥波，江 婷，周才瓊*

(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400716)

卡亞多酚定性定量分析及提取工藝優(yōu)化

俞彥波，江 婷，周才瓊*

(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400716)

以引種栽培的新食物資源——卡亞為原料，對其多酚類進(jìn)行定性定量分析，并以總多酚得率為目標(biāo)，進(jìn)行提取工藝優(yōu)化研究。結(jié)果表明，卡亞含有鞣質(zhì)、多酚和黃酮類物質(zhì)，100g卡亞鮮葉含單寧0.49g、黃酮類1.29g以及酚類2.57g。通過單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，確定卡亞酚類物質(zhì)提取的最佳條件為料液比1:15(g/mL)、溫度60℃、提取時間3h、超聲輔助提取時間20min，100g卡亞鮮樣優(yōu)化提取多酚得率最高為408mg。

新食物資源；卡亞；多酚；提取工藝

卡亞(Cnidoscolus spp.)為大戟科(Euphorbiaceae)葉茂盛的多年生灌木，是瑪雅印第安人“理想的食物和醫(yī)藥”。其廣泛的生物活性包括血液循環(huán)、助消化、改進(jìn)視力、血管痔瘡消炎、降膽固醇、減肥、止咳、骨骼增鈣、預(yù)防貧血、增強(qiáng)記憶、健腦、治療關(guān)節(jié)炎與糖尿病等[1]。有報道卡亞活性成分包括黃酮甙類和三萜類等[2]，Kuti等[3]報道卡亞富含多種酚類化合物和黃酮物質(zhì)，是天然抗氧化劑的良好食品來源。為擴(kuò)展食物新資源——卡亞的應(yīng)用，本實(shí)驗(yàn)擬對引種至重慶栽培的卡亞所含多酚類物質(zhì)采用單因素和正交試驗(yàn)，以期提高卡亞多酚的提取率，并對部分多酚進(jìn)行定性定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

卡亞鮮葉 西南大學(xué)農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)研究室試驗(yàn)田。

無水碳酸鈉、三氯化鐵、鉬酸鈉、鎢酸鈉、磷酸、鐵氫化鉀、濃鹽酸、95%乙醇、氯化鈉、明膠、鎂粉等(均為分析純)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 天津一方科技有限公司。

1.2 設(shè)備與儀器

722分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；FZ102型微型植物粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52A 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 材料預(yù)處理

將新鮮卡亞葉片于50℃鼓風(fēng)干燥箱烘干(水分含量10%以下)，植物微型粉碎機(jī)打碎，過40目篩。取粉粹樣品10g，加10倍量95%乙醇，沸水浴回流提取1h，過濾，濾液備用。

1.3.2 酚類和鞣質(zhì)定性分析

取1.3.1節(jié)醇提液1mL，加入1%三氯化鐵乙醇溶液2～3滴，如有酚類存在時應(yīng)產(chǎn)生綠、藍(lán)或暗紫色反應(yīng)，水樣鞣質(zhì)顯藍(lán)黑色并有沉淀產(chǎn)生，縮合鞣質(zhì)顯墨黑色沉淀。取醇提取液1mL，加入明膠-氯化鈉溶液，如有鞣質(zhì)存在則產(chǎn)生沉淀。取醇提液1滴于濾紙上，噴灑三氯化鐵-鐵氫化鉀試劑(2%三氯化鐵水溶+1%鐵氫化鉀水溶液)，如有酚類存在產(chǎn)生藍(lán)色斑。鹽酸-鎂粉實(shí)驗(yàn)檢測黃酮類。

1.3.3 部分酚類物質(zhì)定量分析

總黃酮含量測定采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法[4]；多酚含量測定采用Folin-ciocalteu法[5]。

1.3.4 卡亞多酚類物質(zhì)提取工藝優(yōu)化

以不同乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間、提取溫度和超聲輔助提取時間進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，將料液比、提取時間、溫度和超聲波輔助時間作為因素，設(shè)置L9(34)正交試驗(yàn)，對卡亞多酚提取得率條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.5 Folin-ciocalteu試劑法[6]測定酚類物質(zhì)

1)Folin-ciocalteu試劑的制備：在500mL磨口回流裝置內(nèi)，加入20g鎢酸鈉、5g鉬酸鈉、70mL去離子水，再加入10mL 85%磷酸及20mL濃鹽酸，充分混勻后，以小火回流10h，再加入30g硫酸鋰，10mL去離子水及數(shù)滴液溴，然后開口繼續(xù)沸騰15min，以便去除過量的溴。冷卻后，定容至200mL，置棕色瓶中保存于冰箱。使用時以1體積水加1體積試劑稀釋。

2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：稱取0.1g沒食子酸，定容至100mL，吸取上述溶液1mL，定容至50mL，使溶液質(zhì)量濃度0.02mg/mL，分別取0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液與1mL Folin-Ciocalteu試劑反應(yīng)，混勻，加入15% Na2CO3溶液3mL，加去離子水補(bǔ)足體積至10mL。室溫靜置40min，測其在波長765nm處的吸光度，以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、A765nm為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3)樣品的測定：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線制定的步驟測定，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算相應(yīng)的多酚類物質(zhì)含量。

Folin-Ciocalteu法制作沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)吸光度與質(zhì)量濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得其線性方程為y=0.0164x－0.0214(R2=0.999)。

2 結(jié)果與分析

2.1 卡亞酚類物質(zhì)的定性定量分析

表1顯示卡亞葉含有鞣質(zhì)和酚類物質(zhì)。經(jīng)定量分析顯示100g卡亞鮮葉含單寧0.49g、黃酮類1.29g以及酚類2.57g。

表1 卡亞葉酚類物質(zhì)初步定性分析結(jié)果Table 1 Results of qualitative analysis for phenols in Chaya leaves

2.2 卡亞酚類物質(zhì)提取單因素試驗(yàn)[7]

多酚在水溶液中有良好的溶解性，但由于多酚在植物中常與多糖、蛋白質(zhì)等以氫鍵和疏水鍵形成穩(wěn)定的復(fù)合物，所以選擇多酚提取溶劑時除了要求溶劑對多酚有很好的溶解性外，還必須有斷裂氫鍵的作用。所有水與有機(jī)溶劑的復(fù)配體系較適合多酚提取，考慮到成本和毒性問題，選擇乙醇與水進(jìn)行復(fù)配作為提取溶劑。

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對酚類物質(zhì)提取的影響

在料液比1:15(g/mL)條件下，分別采用體積分?jǐn)?shù)0%、20%、40%、60%、80%的乙醇溶液50℃恒溫提取2h，結(jié)果見圖1。酚類物質(zhì)提取量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增大而呈下降趨勢，100g鮮樣所得總酚量從470mg下降至310mg?？紤]到水溶液提取濃縮較困難，后續(xù)正交優(yōu)化試驗(yàn)選用20%乙醇溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對酚類提取的影響Fig.1 Effects of ethanol concentration on extraction rate of phenols in Chaya leaves

2.2.2 提取時間對酚類物質(zhì)提取的影響

圖2 提取時間對酚類物質(zhì)提取的影響Fig.2 Effects of extraction time on extraction rate of phenols in Chaya leaves

采用20%乙醇體積分?jǐn)?shù)，料液比1:15條件下，分別在50℃恒溫提取1、2、3、4、5h，卡亞酚類物質(zhì)得率見圖2。隨提取時間延長，酚類物質(zhì)的提取效果出現(xiàn)先增后減的趨勢，在3h達(dá)到最高峰為382mg。

2.2.3 提取溫度對酚類物質(zhì)提取的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)20%，料液比1:15條件下，分別在30、40、50、60、70℃對卡亞提取3h，多酚得率見圖3。隨提取溫度升高，酚類物質(zhì)提取量呈先升后降的趨勢，在50℃時酚類物質(zhì)得率最高達(dá)366mg。

圖3 提取溫度對酚類物質(zhì)提取的影響Fig.3 Effects of extraction temperature on extraction rate of phenols in Chaya leaves

2.2.4 料液比對酚類物質(zhì)提取的影響

采用20%乙醇體積分?jǐn)?shù)，分別在1:5、1:10、1:15、1:20、1:25料液比的條件下50℃提取2h，測定料液比對卡亞酚類物質(zhì)提取效果的影響。結(jié)果見圖4，隨料液比提高，酚類物質(zhì)得率逐漸增加，但當(dāng)料液比超過1:15后，酚類得率增加趨勢變緩?？紤]后續(xù)濃縮及成本問題，選擇1:15左右的料液比例對酚類物質(zhì)進(jìn)行優(yōu)化提取。

圖4 料液比對酚類物質(zhì)提取效果的影響Fig.4 Effects of material/liquid ratio on extraction rate of phenols in Chaya leaves

2.2.5 超聲輔助提取對酚類物質(zhì)提取的影響

采用20%乙醇體積分?jǐn)?shù)，料液比1:15，在50℃提取3h，分別設(shè)置超聲輔助提取時間為10、20、30、40、60min，結(jié)果見圖5。隨著超聲處理時間延長，酚類提取效果呈先升后降趨勢，在超聲處理30min時多酚最高達(dá)412mg。

圖5 超聲輔助時間對酚類物質(zhì)提取的影響Fig.5 Effects of ultrasonic treatment time on extraction rate of phenols in Chaya leaves

2.3 卡亞多酚類提取條件優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上設(shè)計4因素3水平正交試驗(yàn)，各因素水平設(shè)計和試驗(yàn)結(jié)果見表2，在所選4個因素中，影響卡亞酚類得率的因素依次為A＞B＞D＞C，即提取時間＞料液比＞超聲輔助提取時間＞提取溫度。提取卡亞酚類化合物的最佳組合為A2B2C3D1，即提取時間3h、料液比1:15、溫度60℃、超聲輔助提取20min，此時100g鮮樣進(jìn)行提取所得多酚可達(dá)408mg。

表2 卡亞多酚類提取條件正交試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果Table 2 Orthogonal array design matrix and corresponding experimental results

3 討論與結(jié)論

多酚類化合物是指其分子結(jié)構(gòu)中有若干個酚性羥基的植物成分的總稱。都具有一定的抗氧化能力，是優(yōu)良的氫活中子的給予體，能對引起生物組織因產(chǎn)生過氧化作用而代之結(jié)構(gòu)和功能損傷的一些自由基有明顯的清除能力[8]。

經(jīng)對卡亞酚類物質(zhì)進(jìn)行定性分析，卡亞含有酚類包括鞣質(zhì)和黃酮類。卡亞多酚類化合物的提取結(jié)果表明，影響卡亞酚類得率的因素按大小排序?yàn)锳＞B＞D＞C，即提取時間＞料液比＞超聲輔助提取時間＞提取溫度?？▉喍喾宇愇镔|(zhì)提取的最佳溶劑為20%乙醇溶液、提取溫度60℃、提取時間3h、料液比1:15(g/mL)、超聲輔助提取時間20min。

多酚類物質(zhì)極性較大，易溶于極性溶劑，可采用丙酮、甲醇、乙醇、水等極性溶劑提取，但是，綜合毒性、成本、提取率等多種因素，本實(shí)驗(yàn)采用乙醇-水混合體系提取，乙醇體積分?jǐn)?shù)增大但是多酚提取率卻下降，可能是由于溶劑與多酚極性的相似程度降低導(dǎo)致。也可能是因?yàn)楦唧w積分?jǐn)?shù)的乙醇可引起組織中蛋白質(zhì)變性，特別是當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過高時，阻止多酚類物質(zhì)的滲出，影響多酚物質(zhì)的提取得率。同時，高體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液提取物含有較多的色素和親脂性強(qiáng)的成分，這些成分與多酚化合物競爭乙醇-水分子結(jié)合，還可導(dǎo)致多酚得提取得率下降[9]。

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Extraction Optimization and Composition Identification of Polyphenols in Chaya

YU Yan-bo，JIANG Ting，ZHOU Cai-qiong*
(Chongqing Special Food Programme and Technology Research Center, College Food Science, Southwest University,Chongqing 400716, China)

A new food resource, chaya was qualitatively and quantitatively analyzed for its polyphenol components. The extraction of polyphenols from the food resource was optimized based on total polyphenol extraction rate. The results indicated that chaya contained tannins, polyphenols and flavonoids, which were 0.49, 2.57 g and 1.29 g in 100 g of fresh chaya leaves,respectively. The optimal extraction conditions for chaya polyphenols that were determined by single-factor and orthogonal array design were: material/liquid ratio of 1:15, extraction temperature of 60 ℃, extraction time of 3 h and ultrasonic treatment time 20 min. Under the condtions, 408 mg of polyphenols was extracted from 100 g of fresh chaya.

new food resources；Chaya；polyphenol；extraction process

R284.2

A

1002-6630(2011)10-0084-04

2010-08-11

西南大學(xué)博士基金項(xiàng)目(SWUB2008015)

俞彥波(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營養(yǎng)學(xué)。E-mail：yuyanbo1984@163.com

*通信作者：周才瓊(1964—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)化學(xué)。E-mail：zhoucaiqiong@swu.edu.cn