趙莉莉，黃 飚，王曉嵐*，宓曉黎，金 堅(jiān)，陸茂林

(1.江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江蘇省微生物研究所有限責(zé)任公司，江蘇 無(wú)錫 214063；3.江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所，江蘇 無(wú)錫 214063)

恩諾沙星時(shí)間分辨熒光免疫分析方法的建立

趙莉莉1,2，黃 飚3，王曉嵐1,*，宓曉黎2，金 堅(jiān)1，陸茂林2

(1.江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江蘇省微生物研究所有限責(zé)任公司，江蘇 無(wú)錫 214063；3.江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所，江蘇 無(wú)錫 214063)

目的：采用時(shí)間分辨熒光免疫分析(time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)技術(shù)建立高靈敏的恩諾沙星(enrofloxacin，ENR)快速檢測(cè)方法。方法：以包被抗原(ENR-OVA)包被微孔板，與游離的恩諾沙星共同競(jìng)爭(zhēng)抗恩諾沙星抗體，以銪(Eu3+)標(biāo)記的羊抗兔抗體進(jìn)行示蹤。結(jié)果：方法的批內(nèi)變異系數(shù)小于10%、批間變異系數(shù)小于15%，平均回收率為91.62%，靈敏度為5ng/L，可測(cè)范圍為0.01～100μg/L，ED20、ED50和ED80分別為0.088、3.40μg/L和32.81μg/L。結(jié)論：ENR-TRFIA方法穩(wěn)定性好、可測(cè)范圍寬，具有很好的應(yīng)用前景。

恩諾沙星；時(shí)間分辨熒光免疫分析；獸藥殘留

人工合成的新型抗菌藥物恩諾沙星(enrofloxacin，ENR)是第三代氟喹諾酮類(lèi)藥物(FQNs)之一，在獸醫(yī)學(xué)中很快取得廣泛應(yīng)用[1-2]。但長(zhǎng)期應(yīng)用ENR所產(chǎn)生的不良反應(yīng)、畜禽產(chǎn)品中的殘留以及在環(huán)境中的生態(tài)效應(yīng)等方面的問(wèn)題已引起廣泛關(guān)注[3-7]。許多國(guó)家和組織等都將其列入限制使用的獸藥范圍，并制訂出相應(yīng)的最高殘留限量[8]。目前，美國(guó)已經(jīng)禁止在食用動(dòng)物養(yǎng)殖中使用FQNs；歐盟對(duì)ENR在畜禽肌肉和內(nèi)臟中的殘留限量作了嚴(yán)格規(guī)定，要求ENR和環(huán)丙沙星總量的最高殘留限量(MRL)為30μg/kg，日本2006年修改的恩諾沙星殘留限量標(biāo)準(zhǔn)中明確限定此類(lèi)藥物在水產(chǎn)品中的最高限量為100μg/kg；我國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局規(guī)定恩諾沙星在動(dòng)物肌肉、肝臟中的最大殘留限量分別為100、200μg/kg。因此加強(qiáng)對(duì)該藥在動(dòng)物性食品中的殘留檢測(cè)和監(jiān)督非常必要。

目前對(duì)于恩諾沙星的檢測(cè)多采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)或液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)等[9-11]理化檢測(cè)方法，但這些方法所需設(shè)備昂貴、操作繁瑣且靈敏度有限。近年來(lái)關(guān)于免疫分析的方法也有報(bào)道，應(yīng)用最廣的為酶聯(lián)免疫法[12-15]，但由于酶聯(lián)免疫法檢測(cè)范圍有限，且標(biāo)記物酶易失活，底物見(jiàn)光易分解，受環(huán)境影響較大，一定程度上限制了它的應(yīng)用。

本研究采用時(shí)間分辨熒光免疫分析法(time resolved fluoroisnmunoassay，TRFIA)建立恩諾沙星的高靈敏的檢測(cè)方法，該法具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、示蹤物穩(wěn)定和定量分析量程寬及無(wú)放射性污染等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)全面完善其應(yīng)用基礎(chǔ)研究，并建立相關(guān)的檢測(cè)試劑盒，以滿足國(guó)內(nèi)食品安全檢測(cè)市場(chǎng)的迫切需要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ENR人工抗原(ENR-OVA)和兔抗ENR多克隆抗體 自制；ENR標(biāo)準(zhǔn)品 中國(guó)藥品生物制品檢定所；Eu3+標(biāo)記盒 美國(guó)Perkin-Elmer公司；親和層析純化的羊抗兔IgG、牛血清白蛋白(BSA) 美國(guó)Sigma公司；PD-10柱、Sepharose CL-6B柱 美國(guó)Pharmacia公司。

去離子超純水、增強(qiáng)液、洗滌液 自配；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；ELISA試劑盒 北京望爾生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AutoDELFIA-1235全自動(dòng)TRFIA檢測(cè)儀 美國(guó)EG&G-Wallac公司；3550-UV酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 Eu3+-羊抗兔抗體的制備

取0.5mg羊抗兔抗體，經(jīng)PD-10柱轉(zhuǎn)換緩沖條件，洗脫液為含0.155mol/L NaCl的50mmol/L Na2CO3-NaHCO3pH8.5緩沖液。收集蛋白峰，濃縮后取0.3mg羊抗兔抗體，加入含0.1mg的Eu3+-N2-[p-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)凍干粉的小瓶中，30℃磁力攪拌反應(yīng)20h。反應(yīng)液經(jīng)用80mmol/L Tris-HCl pH7.8緩沖液平衡的Sepharose CL-6B柱(1cm×40cm)層析，A280監(jiān)測(cè)收集蛋白峰，稀釋后分裝凍干保存。

1.3.2 試劑配制

ENR標(biāo)準(zhǔn)品：從ENR母液中稀釋ENR，質(zhì)量濃度分別為0.00、0.01、0.50、5.00、20.00、100.00μg/L，稀釋液和零質(zhì)量濃度點(diǎn)均為蒸餾水。

分析緩沖液：8mmol/L NaCl、0.1% BSA、50μmol/L二乙烯三胺五乙酸(diethylenetriamine pentoacetic acid，DTPA)、100mmol/L吐溫-80和0.1% NaN3的Tris-HCl(50mmol/L，pH7.8)。

1.3.3 固相抗原的制備[16]

將包被抗原ENR-OVA用50mmol/L Na2CO3-NaHCO3pH9.6緩沖液稀釋至所需質(zhì)量濃度的包被液，96孔微孔板各孔加100μL，4℃放置過(guò)夜。棄去包被液，沖洗3次，加200μL含3g/L BSA的上述緩沖液封閉，4℃放置過(guò)夜。棄去封閉液，真空抽干，板條密封后置－20℃冷凍保存。

1.3.4 樣品處理

分別稱(chēng)取(4±0.04)g鰻魚(yú)試樣置于50mL離心管中，加乙腈-0.1mol/L氫氧化鈉溶液12mL，振蕩混合5min，4000r/min離心5min；移取上清液6mL于50mL離心管中，加0.02mol/L磷酸鹽緩沖液6mL，再加二氯甲烷7mL，振蕩5min，4000r/min離心5min，取下層有機(jī)相6mL于10mL試管中，于50℃水浴下氮?dú)獯蹈桑患?.02mol/L磷酸鹽緩沖液0.5mL，渦動(dòng)混勻2min，加正己烷1mL，渦動(dòng)混勻30s，4000r/min離心5min；取下層清液50μL分析。稀釋倍數(shù)為0.5倍。

1.3.5 檢測(cè)步驟

從－20℃冰箱中取出ENR-OVA板條，加入50μL/孔ENR標(biāo)準(zhǔn)品或處理好的樣品，然后加入分析緩沖液稀釋的兔抗ENR抗體，50μL/孔，37℃恒溫振蕩孵育1h，洗滌3次后，加入分析緩沖液稀釋的Eu3+-羊抗兔抗體100 μL/孔，37℃恒溫振蕩孵育0.5h，洗滌6次后，加增強(qiáng)液200μL/孔，振蕩5min后，用時(shí)間分辨免疫檢測(cè)儀測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中ENR含量。

1.3.6 間接競(jìng)爭(zhēng)ENR-TRFIA方法的考核

1.3.6.1 靈敏度

計(jì)算10組標(biāo)準(zhǔn)曲線零質(zhì)量濃度點(diǎn)計(jì)數(shù)的平均值(x)和標(biāo)準(zhǔn)差(s)，從標(biāo)曲線中找到x－2s所得值，對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度即為檢測(cè)靈敏度。

1.3.6.2 穩(wěn)定性

比較計(jì)數(shù)為零質(zhì)量濃度點(diǎn)計(jì)數(shù)的20%、50%和80%時(shí)的效應(yīng)值(effective dose，ED)ED20、ED50和ED80對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度/(μg/L)，根據(jù)長(zhǎng)期多次和加速試驗(yàn)測(cè)定判斷劑量反應(yīng)曲線的位置漂移來(lái)考核方法的穩(wěn)定性。

1.3.6.3 回收率

在確定本底的鰻魚(yú)中分別添加5個(gè)濃度水平的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)TRFIA檢測(cè)。計(jì)算實(shí)測(cè)值與理論值的比值。

1.3.6.4 精密度

用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液配制不同質(zhì)量濃度的樣品，觀察批內(nèi)和批間變異系數(shù)(CV)。

1.3.6.5 特異性實(shí)驗(yàn)

按照1.3.5節(jié)檢測(cè)步驟進(jìn)行ENR-TRFIA檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)各質(zhì)量濃度點(diǎn)和零質(zhì)量濃度點(diǎn)的熒光計(jì)數(shù)值計(jì)算抑制率，并以抑制率和恩諾沙星質(zhì)量濃度的常用對(duì)數(shù)值作圖，半數(shù)抑制質(zhì)量濃度IC50為抑制率達(dá)到50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的恩諾沙星質(zhì)量濃度。以恩諾沙星類(lèi)似的其他喹喏酮類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)品為競(jìng)爭(zhēng)物，按照同樣操作條件進(jìn)行與恩諾沙星抗體的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)，分別計(jì)算各藥物的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度IC50，并根據(jù)下式計(jì)算交叉反應(yīng)率：交叉反應(yīng)率/%=[IC50(恩諾沙星)/類(lèi)似藥物的IC50]×100。重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。

1.3.6.6 基質(zhì)效應(yīng)性(健全性)

考察樣品介質(zhì)對(duì)方法的干擾。正常的健全性實(shí)驗(yàn)所得出的曲線應(yīng)該與標(biāo)準(zhǔn)曲線重合或者平行。若存在干擾物質(zhì)，則實(shí)驗(yàn)數(shù)值不成比例增加。取含ENR的鰻魚(yú)樣品，按一系列比例稀釋?zhuān)瑢⑾♂尯蟮臉悠酚肊NR-TRFIA測(cè)量，將測(cè)得結(jié)果繪制成曲線。

1.3.6.7 方法比較

取鰻魚(yú)樣品若干份，分別用ENR-TRFIA和商品化ENR-ELISA試劑盒同時(shí)檢測(cè)樣品，比較兩種檢測(cè)方法的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 Eu3+-羊抗兔抗體的理化和免疫學(xué)鑒定

Eu3+標(biāo)記物經(jīng)Sepharose CL-6B層析，收集第一洗脫峰，如圖1所示。以Eu3+標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品為參考，Eu3+-羊抗兔抗體第一洗脫峰的Eu3+濃度為36.7μmol/L、蛋白質(zhì)濃度為3.2μmol/L，即平均每個(gè)羊抗兔抗體分子上連接了11.5個(gè)Eu3+。

圖1 A280檢測(cè)Eu3+ IgG Sepharose CL-6B洗脫峰Fig.1 Elution profile of Eu3+ labeled IgG from a Sepharose CL-6B column

2.2 包被抗原和抗體工作質(zhì)量濃度的選擇

取不同質(zhì)量濃度的ENR包被抗原板條，依次加入ENR標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，然后每孔依次加入抗ENR抗體(1:20000)，進(jìn)行ENR-TRFIA檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，選擇零質(zhì)量濃度點(diǎn)計(jì)數(shù)高且曲線斜率大(靈敏度高)的包被抗原質(zhì)量濃度，結(jié)果如圖2所示。確定包被抗原的質(zhì)量濃度為100μg/L。

圖2 不同包被抗原質(zhì)量濃度條件下的ENR-TRFIA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Effect of envelope antigen concentration on calibration curve of ENR-TRFIA

用不同質(zhì)量濃度的抗ENR抗體建立檢測(cè)方法，以各稀釋度抗ENR抗體的熒光計(jì)數(shù)(B)與最高質(zhì)量濃度抗ENR抗體的熒光計(jì)數(shù)(B0)的比值(B/B0，即結(jié)合率)為縱坐標(biāo)、抗體稀釋比例為橫坐標(biāo)繪制曲線，結(jié)果見(jiàn)圖3。由于30%～50%抗體結(jié)合率對(duì)應(yīng)的稀釋度為最佳抗體反應(yīng)稀釋度，由圖3得出此范圍為96000～48000，因此合適的工作質(zhì)量濃度應(yīng)在此范圍內(nèi)，本實(shí)驗(yàn)選擇1:60000倍稀釋。

圖3 ENR抗體稀釋曲線Fig.3 Dilution curve of anti-ENR antibody by indirect competitive ENR-TRFIA

2.3 ENR-TRFIA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

圖4 間接競(jìng)爭(zhēng)ENR-TRFIA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Calibration curve of indirect competitive ENR-TRFIA

間接競(jìng)爭(zhēng)ENR-TRFIA的結(jié)果經(jīng)Log-Logit函數(shù)數(shù)據(jù)處理所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖4。LogitY=ln[Y/(1－Y)]，Y＝B/B0，式中B0為最大結(jié)合率的熒光計(jì)數(shù)值，即零質(zhì)量濃度點(diǎn)的熒光計(jì)數(shù)值。以零質(zhì)量濃度點(diǎn)發(fā)光值x－2s后的發(fā)光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到的相應(yīng)值為檢測(cè)的靈敏度，方法的靈敏度為5ng/L。由標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)所在的區(qū)間可得，該檢測(cè)方法的檢測(cè)范圍為0.01～100μg/L。

2.3.1 方法的穩(wěn)定性

6條不同時(shí)間進(jìn)行的間接競(jìng)爭(zhēng)ENR-TRFIA的效應(yīng)點(diǎn)均值ED20、ED50和ED80分別為0.088、3.40μg/L和32.81μg/L(表1)，3個(gè)效應(yīng)點(diǎn)的批間變異系數(shù)(CV)均小于10%，說(shuō)明劑量反應(yīng)曲線的位置漂移小，方法的穩(wěn)定性好。將檢測(cè)用試劑置于37℃、7d(相當(dāng)于4℃、6個(gè)月)后測(cè)定，各質(zhì)量濃度點(diǎn)的結(jié)合率平均下降10.6%，如表2所示，因此說(shuō)明試劑盒的貨架期可以滿足實(shí)際應(yīng)用的需要。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的ED20、ED50和ED80值的穩(wěn)定性比較Table 1 ED20, ED50 and ED80 of ENR-TRFIA

表2 方法的破壞性實(shí)驗(yàn)(37℃、7d)Table 2 Destructive test of ENR-TRFIA (37 ℃,7 d)

2.3.2 方法的回收率

表3 間接TRFIA測(cè)定樣品中ENR的回收率Table 3 Recovery rate of ENR from eel samples determined by TRFIA

稱(chēng)取已處理的鰻肉樣品(3.00±0.05)g，分別添加0.1、1.0、10.0、50.0、200.0μg/kg的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行回收率的測(cè)定，高濃度點(diǎn)稀釋到檢測(cè)限范圍內(nèi)再測(cè)，結(jié)果如表3所示。各濃度點(diǎn)的回收率分別為73.5%、93.6%、95.8%、107.6%、87.6%，平均回收率為91.62%。

2.3.3 精密度

用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液配制3份不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，觀察批內(nèi)和批間變異系數(shù)，結(jié)果如表4所示。批內(nèi)變異系數(shù)均小于10%，批間變異系數(shù)均小于15%，該結(jié)果符合免疫分析要求。

表4 ENR-TRFIA批內(nèi)、批間變異率的考核Table 4 Intra- and inter-assays of ENR-TRFIA

2.3.4 方法的特異性

采用間接競(jìng)爭(zhēng)ENR-TRFIA檢測(cè)ENR抗體與其相關(guān)類(lèi)似物的的交叉反應(yīng)率，結(jié)果如表5所示。恩諾沙星抗體對(duì)其他藥物的交叉反應(yīng)率低，對(duì)恩諾沙星的特異性較好。

表5 間接TRFIA測(cè)定恩諾沙星抗體的特異性Table 5 Specificities of enrofloxacin antibody by TRFIA

2.3.5 方法的健全性

圖5 鰻魚(yú)樣品稀釋比例與測(cè)定值相關(guān)性Fig.5 Correlation between dilution rate and determination results in eel samples

取含定量ENR的鰻魚(yú)樣品，質(zhì)量濃度為1000μg/L，按1:10、1:50、1:200、1:2000、1:100000比例稀釋?zhuān)瑢⑾♂尯蟮臉悠酚肊NR-TRFIA測(cè)量，將測(cè)得結(jié)果繪制成曲線，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較。測(cè)定結(jié)果如圖5所示。測(cè)定結(jié)果呈線性關(guān)系，表示此方法具有較好的健全性。

2.3.6 方法的相關(guān)性

用本實(shí)驗(yàn)室建立的ENR-TRFIA方法和國(guó)產(chǎn)商品化ENR-ELISA試劑盒同時(shí)檢測(cè)15份鰻魚(yú)樣品，結(jié)果如表6所示。對(duì)兩種方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行線性回歸分析，相關(guān)系數(shù)為0.9772，表明兩種方法的相關(guān)性很好(圖6)。

表6 酶聯(lián)免疫法和時(shí)間分辨免疫法的樣品檢測(cè)值Table 6 Comparative results of determining eel samples by ENR-ELISA and ENR-TRFIA

圖6 ENR-TRFIA和ENR-ELISA相關(guān)性曲線圖Fig.6 Correlation between ENR-TRFIA and ENR-ELISA in determining eel samples

3 結(jié) 論

TRFIA是超微量檢測(cè)領(lǐng)域中一項(xiàng)新興的檢測(cè)技術(shù)[17]，采用非放射性原子(三價(jià)稀土離子)標(biāo)記技術(shù)，標(biāo)記位點(diǎn)多，極大地提高了方法學(xué)的靈敏度；標(biāo)記方法屬原子標(biāo)記，對(duì)生物活性影響?。患ぐl(fā)光和發(fā)射光譜之間Stock位移大，可提高方法學(xué)的穩(wěn)定性；相對(duì)長(zhǎng)的熒光發(fā)射周期可有效避免環(huán)境因素的干擾。采用TRFIA方法建立的試劑盒具有有效期長(zhǎng)、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、標(biāo)準(zhǔn)曲線量程寬、可全自動(dòng)操作及應(yīng)用范圍廣泛等優(yōu)點(diǎn)[18-19]。

本研究采用稀土離子Eu3+標(biāo)記技術(shù)建立EN RTRFIA，其檢測(cè)的靈敏度較ELISA方法[12]有所增加，可達(dá)5ng/L，測(cè)量范圍為0.01～100μg/L，向鰻魚(yú)樣品中分別添加0.1、1.0、10.0、50.0、200.0μg/kg五個(gè)水平的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品，平均回收率分別為7 3.5%、93.6%、95.8%、107.6%、87.6%。方法的批內(nèi)變異系數(shù)小于10%，批間變異系數(shù)小于15%。特異性實(shí)驗(yàn)表明恩諾沙星抗體與其他喹諾酮類(lèi)藥物交叉反應(yīng)均較低，抗體的特異性很好。從健全性實(shí)驗(yàn)可以看出，待測(cè)物質(zhì)的免疫化學(xué)性質(zhì)是基本相同的，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品劑量反應(yīng)曲線可以準(zhǔn)確地測(cè)定待測(cè)物的含量，所以本方法的健全性很好。同批試劑連續(xù)6個(gè)月應(yīng)用分析，發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線基本重合，無(wú)明顯漂移，非常穩(wěn)定。

ENR-TRFIA是一種快速、經(jīng)濟(jì)、可進(jìn)行大批量樣品篩查的簡(jiǎn)便方法，其在ENR檢測(cè)中的應(yīng)用，將有助于食品安全領(lǐng)域的研究。

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Establishment of a Time-resolved Fluoroimmunoassay for Measuring Enrofloxacin

ZHAO Li-li1,2，HUANG Biao3，WANG Xiao-lan1,*，MI Xiao-li2，JIN Jian1，LU Mao-lin2
(1. School of Medicine and Pharmaceutics, Jiangnan University, Wuxi 214122, China；2. Jiangsu Institute of Microbiology Co. Ltd., Wuxi 214063, China；3. Jiangsu Institute of Nuclear Medicine, Wuxi 214063, China)

A time-resolved fluoroimmunoassay (TRFIA) was developed for the rapid and sensitive detection of enrofloxacin(ENR). In indirect TRFIA format, the envelope antigen composed of ENR and ovalbumin (OVA) was coated onto the microplate,and followed by the incubation with free ENR and anti-ENR polyclonal antibody. A goat anti-rabbit IgG conjugated with europium (Eu3+) was used for the detection. The intra-assay CV (coefficient of variation) of the developed method was less than 10% and the inter-assay CV less than 15%. The average recovery rate was 91.62% and the sensitivity was 5 ng/L. The antibody had a linear response over the range from 0.01μg/L to 100μg/L. The ED20, ED50 and ED80 (80%, 50% and 20% effective doses)were 0.088, 3.40 μg/ L and 32.81 μg/ L, respectively. The high stability and broad detection range allows the TRFIA method to have promising application prospects.

enrofloxacin；time-resolved fluoroimmunoassay；veterinary drug residues

R155.5

A

1002-6630(2011)10-0110-05

2010-06-30

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2008AA10Z425)

趙莉莉(1984—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩u(píng)估。E-mail：zmf743@126.com

*通信作者：王曉嵐(1962—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)。E-mail：wangxl@jiangnan.edu.cn