何鴻舉，樊明濤,*，劉曉嬌，呂麗娟，焦凌霞

(1.西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.河南科技學院食品學院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

擴展青霉DNA提取及PCR檢測條件的優(yōu)化

何鴻舉1，樊明濤1,*，劉曉嬌1，呂麗娟1，焦凌霞2

(1.西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.河南科技學院食品學院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

研究擴展青霉DNA的提取及其聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)檢測條件的優(yōu)化。分別采用玻璃珠法、氯化芐法、玻璃珠+氯化芐法提取擴展青霉菌及對照菌株的基因組DNA，經(jīng)紫外測定和電泳檢測實驗，分析提取DNA的質(zhì)量濃度和純度；同時，根據(jù)擴展青霉多聚半乳糖醛酸酶基因內(nèi)一段保守序列設計合成一對288bp的擴增引物，并對PCR檢測條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明：玻璃珠+氯化芐法提取到的DNA質(zhì)量濃度和純度較理想，擴展青霉DNA可獲得良好的特異性擴增，PCR擴增的最適退火溫度為53～59℃，最適引物濃度為0.04～0.16μmol/L，最適模板質(zhì)量濃度為2.40～5.28μg/mL，dNTPs濃度對PCR擴增影響不大。運用實驗所得優(yōu)化參數(shù)檢測擴展青霉菌，整個過程僅需3～4h，和傳統(tǒng)的培養(yǎng)檢測法相比，該方法可有效提高檢測效率，可進一步將該方法應用于實踐。

擴展青霉；基因組DNA；聚合酶鏈式反應(PCR)；優(yōu)化

目前，我國是世界上最大的蘋果生產(chǎn)國，同時也是蘋果汁生產(chǎn)第一大國，其濃縮蘋果汁出口量已占到世界貿(mào)易量的60%[1]，但由于我國的蘋果汁生產(chǎn)原料主要是殘次落果，加之貯藏加工能力不足，導致大量的蘋果出現(xiàn)腐爛，致使擴展青霉的污染比較嚴重，直接影響了蘋果汁的質(zhì)量[2-3]。

擴展青霉(Penicillium expansum)是一種多細胞絲狀真菌，是棒曲霉素的主要產(chǎn)生菌[4]，棒曲霉素是一種致癌、致畸毒素[5-6]。傳統(tǒng)的擴展青霉檢測主要是培養(yǎng)法[7]，耗時長，無法實現(xiàn)快速檢測的目的，近年來PCR技術在微生物的檢測方面具有明顯優(yōu)勢[8-10]，因此，研究如何快速檢測棒曲霉素產(chǎn)生菌——擴展青霉，并設法在工藝過程中對其進行控制，減少該棒曲霉素產(chǎn)生菌，對提高蘋果汁質(zhì)量具有非常重要的意義。本實驗基于PCR檢測特異性的優(yōu)點，根據(jù)擴展青霉多聚半乳糖醛酸酶基因內(nèi)一段保守序列設計引物，優(yōu)化擴增條件，獲得一套最適擴增擴展青霉DNA的優(yōu)化參數(shù)，以期為實際應用提供理論依據(jù)和方法學參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

擴展青霉(Penicillium expansum) 中國普通微生物菌種保藏管理中心；圓弧青霉(Penicillium cyclopium)、皮落青霉(Penicillium crustosum)、產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)、矮棒曲霉(Aspergillus clavatonanicus)、黃炳曲霉(Aspergillus flavipes)、黑曲霉(Aspergillus niger) 西北農(nóng)林科技大學食品學院微生物實驗室。

1000bp DNA Marker、Taq酶、dNTPs、PCR 緩沖液 日本Takara公司；溴乙錠 西安沃爾森公司；DNA提取液(體積分數(shù)2% Trition X-100、10g/100mL SDS、100mmol/L NaCl、10mmol/L Tris-HCl、1mmol/L EDTA，pH8.0) 自制。

PTC-200 PCR儀 美國MJ Research公司；Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng) 美國伯樂公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種的培養(yǎng)

在無菌操作條件下，將擴展青霉菌和其他菌種接種到察氏培養(yǎng)基(NaNO33.0g、K2HPO41.0g、KCl 0.5g、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O 0.01g、蔗糖30g、瓊脂粉20g，加水定容至1L，臨用前用乳酸調(diào)至pH4.5)，28℃避光培養(yǎng)3～4d，用于提取DNA。

1.2.2 擴展青霉基因組DNA提取方法的篩選

氯化芐法：參照文獻[11]略作修改。用接種環(huán)從察氏培養(yǎng)基平板上刮取大約100mg菌絲體放入裝有400μL DNA提取液的1.5mL離心管中，加150μL 10% SDS、450μL氯化芐原液，旋渦振蕩約10min，52℃水浴1h，每10min振蕩混勻1次；然后加NaAc(3mol/L，下同)450μL，充分顛倒混勻，冰浴15min，15000r/min離心5min；取上清液，加入與其等體積的冰無水乙醇，－20℃沉淀30min，8000r/min離心10min，棄上清液；沉淀于37℃烘至微干，加100μL滅菌超純水，溶解DNA，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

玻璃珠法：參照文獻[12]略作修改。用接種環(huán)從察氏培養(yǎng)基平板上刮取大約100mg菌絲體放入裝有400μL DNA提取液的1.5mL離心管中，加700mg玻璃珠和400μL Tris飽和酚，旋渦振蕩30min，15000r/min離心5min；取上清液，加入與其等體積的酚、氯仿、異戊醇的混合液(25:24:1)，充分顛倒混勻，15000r/min離心5min，抽提2次；取上清液，加入其1/10體積的NaAc及2倍體積的冰無水乙醇，－20℃放置30min，8000r/min離心5min，棄上清液；沉淀加1mL 75%乙醇漂洗1次，于37℃烘至微干，加100μL滅菌超純水溶解DNA，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

玻璃珠+氯化芐法：參照文獻[13]略作修改。用接種環(huán)從察氏培養(yǎng)基平板上刮取大約100mg菌絲體放入含400μL DNA提取液的1.5mL離心管中，加150μL 10%SDS和450μL氯化芐，并加700mg玻璃珠劇烈振蕩30min，直至液體呈乳狀；52℃水浴1h，每10min振蕩混勻1次；15000r/min離心5min；取上清液，加入與其等體積的Tris飽和酚和氯仿的混合液(1:1)，充分顛倒混勻，15000r/min離心5min，抽提2次；取上清液，加入與其等體積的氯仿，充分顛倒混勻，15000r/min離心5min，重復此操作1次；取上清液，加入與其2倍體積的冰無水乙醇，－20℃靜置沉淀30min，8000r/min離心5min，棄上清液；沉淀于37℃烘至微干，加100 μL滅菌超純水溶解DNA，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設計

根據(jù)GenBank中擴展青霉菌株的polygalacturonase基因序列，利用Primer 5.0軟件設計一對引物，上游引物：5'-CGCCAAGAATACACCAACT-3'，下游為：5'-TCCAAAGATAACGGACGAA-3'，擴增片段長度為288bp。引物由日本Takara公司合成。

1.2.4 PCR擴增及電泳

參照文獻[14]調(diào)整反應體系(25μL)為：模板DNA 2.5μL，兩條引物(10μmol/L)各0.5μL，Taq DNA聚合酶 0.2μL，dNTPs(2.5mmol/L)2.0μL，10×PCR緩沖液2.5μL。反應條件為：94℃預變性5min，解鏈94℃ 1min，退火55℃ 30s，延伸72℃ 30s，30個循環(huán)，終延伸72℃10min。取10μL PCR擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，照相觀察。

1.2.5 PCR的特異性檢驗

采用1.2.2節(jié)篩選的方法提取圓弧青霉、皮落青霉、產(chǎn)黃青霉、擴展青霉、黃炳曲霉、矮棒曲霉、黑曲霉、7種真菌的DNA，并采用1.2.4節(jié)的體系擴增擴展青霉菌，檢驗PCR擴增的特異性。

1.2.6 PCR擴增條件的優(yōu)化

在預實驗的基礎上分別選取退火溫度、引物濃度、模板濃度和dNTPs濃度等因素進行PCR擴增條件的優(yōu)化實驗，以獲得最適檢測擴展青霉菌的擴增條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取方法的篩選

一般而言，優(yōu)質(zhì)的DNA的OD260/OD280值在1.8～2.0之間，紫外測定結(jié)果如表1所示。玻璃珠+氯化芐法提取的DNA的OD260/OD280值為1.811，而氯化芐法和玻璃珠法提取的DNA的OD260/OD280值均小于1.8，并且玻璃珠+氯化芐法提取的DNA質(zhì)量濃度明顯高于其他兩種方法。電泳結(jié)果(圖1)表明玻璃珠+氯化芐法提取的DNA有清晰、明亮的條帶，而氯化芐法和玻璃珠法的條帶很弱。紫外測定和電泳結(jié)果均表明玻璃珠+氯化芐法提取的DNA的質(zhì)量濃度和純度明顯優(yōu)于氯化芐法和玻璃珠法。因此選取璃珠+氯化芐法作為本實驗的DNA提取方法，提取7株試驗真菌的DNA，電泳結(jié)果(圖2)顯示均有清晰、明亮的條帶，表明均已提取到DNA。

表1 3種方法提取擴展青霉DNA的純度和質(zhì)量濃度Table 1 The concentration and purity of Penicillium expansum DNAs extracted by three methods

圖1 3種方法提取DNA的電泳結(jié)果Fig.1 Gel electrophoresis of Penicillium expansum DNAs extracted by three methods

圖2 玻璃珠+氯化芐法提取試驗真菌DNA的電泳結(jié)果Fig.2 Gel electrophoresis of DNAs from Penicillium expansum and 6 control fungi extracted by glass bead combined with benzyl chloride method

2.2 PCR的特異性檢測

應用試驗設計的引物對擴展青霉和其他真菌的DNA進行PCR擴增，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示，只有擴展青霉菌擴增出了288bp大小的特異性目的條帶，而其他6種真菌均未得到任何擴增條帶，并且經(jīng)多次實驗，重復性良好。由此可得出在該實驗條件下，此引物建立的PCR檢測方法對擴展青霉具有特異性。

圖3 擴展青霉的PCR特異性檢驗Fig.3 Specificity of primers designed in this study to Penicillium expansum

2.3 最適退火溫度篩選

退火溫度是PCR反應條件的最關鍵因素，由最適退火溫度篩選的實驗結(jié)果(圖4)可看出，退火溫度在52～61℃之間時都能獲得較好的擴增，但溫度過低出現(xiàn)了非特異性條帶，可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果；退火溫度過高，由圖4可看出，PCR的擴增效率似乎有所降低，條帶亮度有所下降，因此本實驗獲得較理想的退火溫度是53～59℃。以下實驗的退火溫度均選用57℃。

圖4 PCR最適退火溫度的篩選Fig.4 Effect of annealing temperature on PCR detection

2.4 最適引物濃度篩選

合適的引物濃度對PCR擴增有很重要的作用，如圖5所示，在所選引物濃度條件下均擴增出了明顯的目的條帶，但不同引物濃度對是否有二聚體形成卻有不同的作用，當引物濃度分別為0.04～0.16μmol/L時，基本無引物二聚體形成；當引物濃度達到0.20～0.28μmol/L時，似乎有微弱的引物二聚體；當引物濃度達到0.32～0.40μmol/L時，引物二聚體非常明顯。因此，此引物適宜的濃度為0.04～0.16μmol/L。引物濃度過高易出現(xiàn)非特異性條帶。以下實驗中引物濃度均選用0.16μmol/L(對應的PCR上樣量為0.40μL)。

圖5 最適引物濃度篩選Fig.5 Effect of primers concentration on PCR detection

2.5 最適模板質(zhì)量濃度篩選

在退火溫度57℃、引物濃度0.16μmol/L的情況下，進行最適模板濃度的篩選實驗，結(jié)果見圖6。當模板質(zhì)量濃度為0.8μg/mL時，沒有擴增出目的條帶；當質(zhì)量濃度在1.44～5.28 μg/mL范圍內(nèi)時均擴增出了明顯的目的條帶，但條帶的亮暗程度不同：模板質(zhì)量濃度為1.44～1.92μg/mL時獲得的擴增條帶亮度較弱，模板質(zhì)量濃度增加至2.40～5.28μg/mL時獲得的擴增條帶清晰明亮。因此，質(zhì)量濃度在2.40～5.28μg/mL之間時，PCR擴增效果良好。模板質(zhì)量濃度過低會影響PCR的擴增效率。以下實驗中模板質(zhì)量濃度均選用2.40μg/mL(對應的PCR上樣量為2.50μL)。

圖6 最適模板質(zhì)量濃度篩選Fig.6 Effect of template concentration on PCR detection

2.6 最適dNTPs濃度篩選

從圖7的最適dNTPs濃度篩選實驗結(jié)果可以看出，在所選dNTPs濃度條件下均擴增出了明顯的目的條帶，而且條帶的亮度基本一樣，說明dNTPs濃度對PCR擴增結(jié)果的影響不大，只要有足夠量的dNTPs就可以達到擴增目的，實際工作中選擇較小的dNTPs濃度以節(jié)約試劑。

圖7 最適dNTPs濃度篩選Fig.7 Effect of dNTPs concentration on PCR detection

2.7 優(yōu)化參數(shù)條件下的PCR檢測

選取優(yōu)化后的參數(shù)(退火溫度為55℃，引物濃度為0.04μmol/L，模板質(zhì)量濃度為3.36μg/mL，dNTPs濃度為0.15mmol/L)。對擴展青霉和其他真菌進行PCR檢測，結(jié)果如圖8所示。擴展青霉獲得了良好的特異性擴增，且擴增條帶明亮清晰，而其他真菌均未獲得擴增條帶，說明優(yōu)化的PCR參數(shù)適合擴展青霉的檢測。

圖8 優(yōu)化參數(shù)條件下的PCR檢測Fig.8 PCR detection of Penicillin expansum under optimized conditions

3 討 論

現(xiàn)有的參考文獻中，真菌DNA的提取方法已報道很多[15-17]，氯化芐法和玻璃珠法就是其中兩種，而提取真菌DNA的首要一步就是破碎細胞壁，破壁效果是否良好直接影響著DNA的提取效果：氯化芐法是基于氯化芐和真菌細胞壁中的多糖反應以達到破碎細胞壁的目的，屬化學法破壁；玻璃珠法是借助玻璃珠相互之間的震動擠壓和剪切力以破碎細胞壁，屬物理法破壁。將這兩種方法分別單獨用于破碎本試驗中擴展青霉菌的細胞壁，以達到釋放DNA的目的，但是由表1和圖1可知，這兩種方法的破壁效果并不理想，沒有使擴展青霉菌中的DNA完全釋放出來，這將會影響到后續(xù)的PCR檢測實驗。借鑒文獻[13]的方法，將氯化芐法和玻璃珠法結(jié)合起來破壁，結(jié)果顯示提取的DNA質(zhì)量明顯優(yōu)于兩種方法分別單獨使用時提取的DNA質(zhì)量，說明氯化芐和玻璃珠聯(lián)合破壁效果要好于兩種方法單獨破壁，化學法和物理法的雙重作用使DNA得到了比較充分的釋放，可滿足PCR檢測的需要。

在現(xiàn)有的擴展青霉PCR檢測研究報道中，擴增引物及PCR檢測條件各不相同，Paterson[10]和Marek[14]分別利用引物ISO和引物POL對擴展青霉的PCR檢測進行了初步的研究，袁暉等[18]利用真菌通用引物探討了擴展青霉的PCR檢測，然而，采用這幾種引物及其相應的PCR檢測體系并不能特異性的擴增本實驗中的擴展青霉菌，為此，本實驗根據(jù)擴展青霉polygalacturonase基因內(nèi)一段保守序列重新設計了一對288bp的擴增引物，并在Patrick的研究基礎上優(yōu)化了PCR檢測條件。擴增結(jié)果顯示PCR檢測擴展青霉菌獲得了良好的特異性，優(yōu)化結(jié)果顯示PCR最適退火溫度為53～59℃，最適引物濃度為0.04～0.16μmol/L，最適模板質(zhì)量濃度為2.40～5.28 μg/mL，而dNTPs濃度對PCR擴增影響不大，運用實驗所得優(yōu)化參數(shù)檢測擴展青霉菌，整個過程僅需3～4h，和傳統(tǒng)的培養(yǎng)法檢測相比，有效地提高了檢測效率。建立的這套檢測體系可為進一步開展擴展青霉的分子生物學研究及實際應用提供理論借鑒。

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Optimization of DNA Extraction and PCR Detection from Penicillium expansum

HE Hong-ju1，F(xiàn)AN Ming-tao1,*，LIU Xiao-jiao1，LLi-juan1，JIAO Ling-xia2
(1. College of Food Science and Engineering, Northwest A & F University, Yangling 712100, China；
2. College of Food Science, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, China)

The genome DNAs of Penicillium expansum and 6 control fungi were extracted by glass bead method, benzyl chloride method and their combination, respectively. The concentration and purity of DNAs were analyzed by UV spectroscopy and gel electrophoresis. Meanwhile, a pair of primers with a size of 288 bp were designed and synthesized based on a conservative sequence of Penicillium expansum's polygalacturonase gene to conduct the PCR detection. The results showed that combined use of glass bead and benzyl chloride was more effective than either alone. Good specific amplification of DNA was obtained, and the optimal range of annealing temperature was between 53 ℃ and 59 ℃, and the optimal range of primer concentration between 0.04 μmol/L and 0.16 μmol/L, and the optimal range of template concentration between 2.40 μg/mL and 5.28 μg/mL.Meanwhile, dNTPs concentration had little influence on PCR amplification. The method requiring only 3 to 4 hours could evidently enhance detection efficiency when compared to traditional methods. As a result, it has promising potential to be further applied in practice.

Penicillium expansum；genome DNA；polymerase chain reaction (PCR)；optimization

Q939.5

A

1002-6630(2011)10-0115-05

2010-07-07

教育部博士點基金項目(200807120017)；陜西省科技攻關項目(2007K01-12)

何鴻舉(1983—)，男，碩士研究生，主要從事食品生物技術研究。E-mail：hhj1030@nwsuaf.edu.cn

*通信作者：樊明濤(1963—)，男，教授，博士后，主要從事食品微生物及食品安全研究。E-mail：mingtaofan@tom.com