王凱 鄭春泉

變應(yīng)性鼻炎是一種常見病，其發(fā)病機(jī)制為傳統(tǒng)的“Th1-Th2失衡理論”［1］，但目前還有很多現(xiàn)象無法解釋。有證據(jù)表明，Th1-Th2反應(yīng)失衡很可能僅為變應(yīng)性疾病發(fā)病的冰山一角。自然殺傷T(natural killer T，NKT)細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)，或許為深入探討變應(yīng)性疾病的發(fā)病機(jī)制提供方向。NKT細(xì)胞是一類特殊的細(xì)胞亞群，既表達(dá)T細(xì)胞的表面標(biāo)志物，也表達(dá)NK細(xì)胞表面的一些特異性分子［2］。NKT細(xì)胞可迅速分泌大量具有免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素4(interleukin，IL-4)、γ 干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、IL-10 及IL-13。這些細(xì)胞因子可以調(diào)節(jié)體內(nèi)的免疫反應(yīng)。為進(jìn)一步了解NKT細(xì)胞在變應(yīng)性鼻炎發(fā)病中的作用，本研究采用免疫化學(xué)染色方法檢測NKT細(xì)胞的標(biāo)記物CD4+和NK 1.1，并應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測鼻腔黏膜中的CD4+iNKT細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 C57BL/6成年小鼠30只，雌雄不拘，體質(zhì)量27～30 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司，均排除鼻部疾病。

1.1.2 主要試劑與儀器 試劑:FITC抗小鼠CD4+(BioLegend，美國)、PE 抗小鼠 NK1.1(BioLegend，美國)。儀器:FCSCalib流式細(xì)胞儀(Becton-Dickinson，美國)，熒光顯微鏡(DMIRB，Leica，德國)。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模 將30只小鼠隨機(jī)分為變應(yīng)性鼻炎組(A組)和健康對組照(B照)，每組15只。變應(yīng)性鼻炎模型的制備方法為傳統(tǒng)卵清白蛋白法［3］。

1.2.2 鼻部癥狀評分標(biāo)準(zhǔn) 1分:噴嚏1～3個(gè)，清涕流至前鼻孔，單前肢偶有撓鼻;2分:噴嚏4～10個(gè)，清涕超過前鼻孔，雙前肢撓鼻;3分:噴嚏10個(gè)以上，清涕流至面部，不停到處擦鼻?！?分為造模成功。

1.2.3 鼻黏膜組織學(xué)觀察 制作石蠟切片并進(jìn)行蘇木素-伊紅(hematoxylin eosin，HE)染色，在顯微鏡下觀察2組動物的鼻黏膜組織形態(tài)。

1.2.4 免疫酶標(biāo)技術(shù)檢測鼻腔黏膜中CD4+iNKT細(xì)胞浸潤 取出標(biāo)本并立即浸泡于4%多聚甲醛中，4℃冰箱放置24 h;脫鈣液脫鈣48 h;0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)漂洗3次;15%蔗糖浸泡6 h，30%蔗糖浸泡24 h;制作冷凍切片。室溫下冷凍切片靜置2 h至自然風(fēng)干;PBS洗片5 min，共3次;滴 0.4%Triton X-100，37 ℃ 30 min;PBS洗片 5 min，共3次;山羊血清封閉液室溫下封閉30 min;每張切片滴加 1∶50 FITC抗小鼠 CD4+30 μL，37℃孵育1 h;PBS洗片5 min，共3次;甘油封片;在熒光顯微鏡下觀察。用PE抗小鼠NK1.1對NK1.1進(jìn)行染色，步驟同CD4+染色。

1.2.5 FCM檢測鼻腔黏膜中的CD4+iNKT細(xì)胞 將鼻腔黏膜塊放入勻漿機(jī)樣本槽內(nèi)，加適量PBS處理2 min;打開樣本槽，抽取組織勻漿;用200目細(xì)胞濾網(wǎng)過濾到冰預(yù)冷的試管內(nèi);離心、沉淀;300目細(xì)胞濾網(wǎng)過濾細(xì)胞塊。細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為2×1010L－1，4℃保存待用。將懸液每份50 μL加入流式管中，加入50 μL PBS稀釋的 FITC抗小鼠 CD4+、PE抗小鼠NK1.1，使其達(dá)到工作濃度，進(jìn)行膜表面熒光標(biāo)記，F(xiàn)CM檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料用表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鼻部癥狀評分 A組所有動物評分≥5分，提示造模成功。A組癥狀評分為(7.3±1.0)分，B組癥狀評分為(0.7±0.6)分，A 組明顯高于B 組(P ＜0.01)。

2.2 鼻黏膜組織形態(tài) A組見纖毛結(jié)構(gòu)大量脫落、組織水腫、小血管增生、黏膜上皮下固有層嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophils，EOS)和淋巴細(xì)胞浸潤(附1頁圖1)。B組見纖毛排列整齊，粗細(xì)均勻一致，無脫落、缺失現(xiàn)象，固有層未見明顯EOS浸潤(附1頁圖2)。

2.3 鼻黏膜中EOS計(jì)數(shù) A組EOS計(jì)數(shù)為(7.5±1.2)個(gè)/HP，B 組為(0.4 ±0.5)個(gè)/HP，A 組明顯高于B 組(P ＜0.01)。

2.4 免疫熒光染色 A組小鼠鼻腔黏膜中有大量被黃綠色熒光標(biāo)記的CD4+細(xì)胞(附1頁圖3)和被紅色熒光標(biāo)記的NK1.1+細(xì)胞(附1頁圖4)浸潤，主要集中在黏膜下層和固有層。將圖3和圖4進(jìn)行疊加得到(附1頁圖5)，即被CD4+抗體標(biāo)記的細(xì)胞絕大部分同時(shí)也被NK1.1抗體標(biāo)記，而CD4+和NK1.1雙陽性細(xì)胞即為CD4+iNKT細(xì)胞。由圖可見變應(yīng)性鼻炎小鼠的鼻腔黏膜有大量CD4+iNKT細(xì)胞浸潤。B組小鼠鼻腔黏膜中只見少量、散在的CD4+細(xì)胞存在(附1頁圖6)。

2.5 流式細(xì)胞檢測 兩組各7個(gè)標(biāo)本中，CD4+和NK1.1雙陽性細(xì)胞占 CD4+細(xì)胞的比例:A組為63% ～86%，平均 72.6% ±7.9%;B 組為 0.3% ～0.7%，平均0.49% ±0.1%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)，提示變應(yīng)性鼻炎小鼠鼻腔黏膜中的CD4+細(xì)胞中，CD4+iNKT細(xì)胞占大多數(shù)(表1、圖7)。

表1 兩組樣本的NKT細(xì)胞陽性率(CD4+iNKT細(xì)胞/CD4+細(xì)胞)分布情況(%)

3 討論

NKT細(xì)胞既表達(dá)T細(xì)胞表面標(biāo)志物，如T細(xì)胞受體、CD3等，也表達(dá)NK細(xì)胞表面的一些特異性分子，如 NKl.1(NKR-PIC)、CD161等。最初發(fā)現(xiàn)，NKT 細(xì)胞為一群表達(dá)NK細(xì)胞表面標(biāo)記分子的T細(xì)胞，它們是CD4+或CD4－CD8－(DN)，其顯著特征是CD1d限制，即可被CD1d呈遞的糖脂類抗原激活，迅速分泌大量的IFN-γ和IL-4。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)NKT細(xì)胞在不同的情況下，分泌的細(xì)胞因子類型和數(shù)量及NKT細(xì)胞的細(xì)胞毒作用均存在很大差異。目前研究［4-5］表明，NKT細(xì)胞在抗感染免疫、抗腫瘤免疫，以及自身免疫性疾病的調(diào)節(jié)和移植免疫中均起到重要作用。Meyer等［6］發(fā)現(xiàn)，NKT細(xì)胞在變應(yīng)性哮喘的發(fā)病中發(fā)揮非常關(guān)鍵的作用，其作用甚至超過CD4+T細(xì)胞，建議將NKT細(xì)胞作為變應(yīng)性疾病治療的靶細(xì)胞。本研究也表明，變應(yīng)性鼻炎小鼠的鼻腔黏膜中存在大量的NKT細(xì)胞浸潤，數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過CD4+T細(xì)胞。但是目前的觀點(diǎn)仍認(rèn)為，CD4+T細(xì)胞是主要浸潤細(xì)胞，由其分泌的IL-4、IL-5及IL-13在整個(gè)變應(yīng)性疾病的發(fā)病過程中起著重要作用［7］。

圖7.A組流式細(xì)胞技術(shù)二維點(diǎn)圖(左圖):標(biāo)本中存在大量的CD4和NK1.1雙陽性細(xì)胞細(xì)胞，其數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過CD4+細(xì)胞;B組流式細(xì)胞技術(shù)二維點(diǎn)圖(右圖):標(biāo)本中CD4+細(xì)胞很少

對于變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病機(jī)制，目前比較一致的觀點(diǎn)是“Th細(xì)胞平衡失調(diào)理論”。該理論認(rèn)為，變應(yīng)性鼻炎是體外環(huán)境因素作用于機(jī)體造成Thl和Th2免疫反應(yīng)失衡，而引發(fā)的以鼻腔黏膜Th2免疫反應(yīng)為主的變應(yīng)性炎癥。CD4+T細(xì)胞，即T輔助細(xì)胞及其相關(guān)的細(xì)胞因子產(chǎn)物，在變應(yīng)性鼻炎的發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。IFN-γ和IL-4分別是Th1型和Th2型免疫反應(yīng)的代表性細(xì)胞因子，而NKT細(xì)胞可以分泌IFN-γ和IL-4，因此NKT細(xì)胞也可能控制著變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病。與傳統(tǒng)的觀點(diǎn)不同，本研究采用熒光染色、FCM檢測，證明在變應(yīng)性鼻炎小鼠的鼻腔黏膜中，有大量的CD4+iNKT細(xì)胞浸潤，數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過CD4+T細(xì)胞。所以我們認(rèn)為，在變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病中，CD4+iNKT細(xì)胞發(fā)揮著重要的作用。至于其作用機(jī)制，本研究表明與IFN-γ和IL-4細(xì)胞因子有關(guān)，因?yàn)槲覀冡槍KT細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)NKT細(xì)胞通過控制IFN-γ和IL-4的分泌對變應(yīng)性鼻炎的癥狀進(jìn)行調(diào)控?；贜KT細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病中扮演著重要角色，也許NKT細(xì)胞將會成為治療變應(yīng)性鼻炎很有前途的靶細(xì)胞。

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