王鋒 王德輝

慢性鼻竇炎是鼻竇黏膜的一種慢性炎癥性疾病，黏液髙分泌、杯狀細胞增生、化生是其特征性病理變化。黏液的蛋白成分是黏蛋白，而鼻竇黏膜上皮主要分泌黏蛋白 MUC5AC，由杯狀細胞產(chǎn)生。MUC5AC表達受多種炎性介質(zhì)的影響，如白細胞介素(interleukin 4，IL-4)、IL-6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和中性粒細胞彈性蛋白酶等。在慢性鼻竇炎中，鼻竇黏膜上皮杯狀細胞增生，MUC5AC表達上調(diào)［1］，但這些炎性介質(zhì)調(diào)控MUC5AC表達的具體機制并不清楚。Ca2+激活的氯離子通道1(human calcium-activated chloride channel，hCLCA1，在鼠是 gob5)是近年來發(fā)現(xiàn)的新的跨膜氯離子通道家族成員。Nakanishi等［2］研究表明，哮喘大鼠的gob5在氣道上皮杯狀細胞選擇性表達增加，氣道上皮的杯狀細胞數(shù)也明顯增多，黏蛋白分泌、MUC5AC mRNA表達也隨之增加。用表達hCLCA1基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NCI-H292細胞(一種人氣道黏液上皮細胞系)，可直接引起MUC5AC表達增加和黏液細胞增殖活性增高［2］，提示 hCLCA1可能作為上游因子調(diào)節(jié)黏蛋白表達。在哮喘、慢性阻塞性肺病及肺囊性纖維化等下呼吸道疾病患者中［3-5］，hCLCA1的表達較健康人增高，表明hCLCA1與這些下呼吸道疾病的黏液髙分泌機制有關(guān)。但hCLCA1在慢性鼻竇炎的發(fā)病機制中是否發(fā)揮作用，目前還不清楚。本實驗檢測了hCLCA1在慢性鼻竇炎黏膜上皮的表達情況，探討hCLCA1與慢性鼻竇炎的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 取2009年2～6月在我科行鼻內(nèi)鏡手術(shù)患者的篩竇黏膜(患者均知情同意)。慢性鼻竇炎不伴鼻息肉患者10例，其中男性4例、女性6例;年齡19～53歲，平均35.6歲。根據(jù)病史、體格檢查、鼻竇CT掃描、鼻內(nèi)鏡，以及病理檢查，患者均已診斷明確。所有患者均無變應(yīng)性疾病及肺部伴發(fā)疾病。另取10例正常篩竇黏膜作為對照組，來自因外傷性視神經(jīng)損傷、Grave眼病和腦脊液鼻漏而行鼻內(nèi)鏡手術(shù)的患者，其中男性6例、女性4例;年齡20～52歲，平均41.2歲。標(biāo)本分兩部分處理:一部分放入4%多聚甲醛過夜，用于免疫熒光實驗;另一部分迅速放入液氮中，－80℃保存，用于定量mRNA檢測。

免疫熒光用抗體包括羊抗人hCLCA1多克隆抗體(Santa Cruz公司，美國);FITC標(biāo)記兔抗羊IgG抗體(Zymed公司，美國)。Real-time試劑包括 Trizol(Invitrogen公司，美國)，Real-time用試劑盒(Fermentas公司)，定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀 (ABI 7300，Applied Biosystems公司，美國)，實時 PCR Master Mix(SYBR Green，Toyobo公司，日本)。熒光顯微鏡(DMR30型，Leica，德國)和冷凍切片機(CM3050 型，Leica，德國)。

1.2 方法

1.2.1 免疫熒光 標(biāo)本常規(guī)處理，4%多聚甲醛固定，蔗糖脫水，冷凍包埋劑包埋;冷凍切片機下連續(xù)切片5張，層厚5 μm，室溫干燥2 h后常規(guī)熒光染色;一抗4℃過夜，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)沖洗后，二抗37℃孵育1 h，2種抗體工作濃度均為1∶100。以PBS代替一抗做陰性對照。封片后熒光顯微鏡拍照。所有拍照均在同一參數(shù)下完成。

1.2.2 實時定量PCR 按試劑盒說明進行。以Trizol試劑提取總RNA，取1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，采用SYBR Green綠熒光染料實時定量PCR檢測hCLCA1 mRNA的表達，以磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)做內(nèi)參。引物序列如下:hCLCA1引物，上游5'CAATCGACTGAATCAAGCAG3';下游 5'CCACTGTTTATCTGTATGAG 3';GAPDH引物，上游 5'TGACTTCAACAGCGACACCCA3'，下 游 5'GTCCACCACC CTGTTGCTGTAG3'。反應(yīng)在ABI 7300定量PCR儀上進行，PCR 反應(yīng)總體系 25 μL，其中 2X RT mix 12.5 μL，cDNA(稀釋 10 倍)1 μL，上、下游引物 5 pmol/μL，各1 μL，去離子水補足25 μL。反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min，45個循環(huán);94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 1 min，55 ℃1 min，融解曲線，81個循環(huán)。

1.3 結(jié)果判斷 在熒光顯微鏡下，觀察鼻竇黏膜不同上皮細胞的熒光染色強度，分為強陽性(+++)、中度陽性(++)、弱陽性(+)及陰性(－)。計算每個高倍視野下陽性細胞面積與鼻竇黏膜上皮面積比:每個標(biāo)本隨機取1張切片，每個切片取10個高倍視野(×200)，通過熒光顯微鏡圖像處理軟件(Leica Qwin V3)計算每個高倍視野下陽性細胞與整個黏膜上皮的面積比，取平均值。2－△△Ct值表示基因相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 統(tǒng)計分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，各組陽性細胞面積比以表示，對各組均值進行兩獨立樣本Mann-Whitney U檢驗。

2 結(jié)果

2.1 hCLCA1蛋白在鼻竇黏膜上皮中的表達hCLCA1表達于鼻竇黏膜上皮杯狀細胞，慢性鼻竇炎組表現(xiàn)較強的熒光染色(+++)(附1頁圖1)，而正常鼻竇黏膜熒光染色呈弱陽性(+)或陰性(－)(附1頁圖2、表1)。慢性鼻竇炎組陽性細胞面積與黏膜上皮面積比為51.6% ±4.5%，對照組為7.2% ±5.1%，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)(表2)。陰性對照組中無陽性染色。

表1 hCLCA1在各組黏膜上皮細胞中的表達定位

表2 hCLCA1在各組陽性細胞面積比均值(n=10，高倍視野×200)

2.2 hCLCA1mRNA在各組鼻竇黏膜上皮中的表達

在慢性鼻竇炎組，鼻竇黏膜的hCLCA1 mRNA在鼻竇黏膜中呈高表達，在對照組表達水平較低，前者的平均表達水平是后者的49.7倍，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01，圖3)。

圖3.hCLCA1在慢性鼻竇炎組的表達與健康對照組比較＊示 P ＜0.01

3 討論

慢性鼻竇炎是耳鼻喉科常見的慢性炎癥性疾病，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。鼻腔、鼻竇黏液過度分泌是慢性鼻竇炎特征性病理改變之一。過度的黏液分泌引起患者大量流涕，加重鼻塞，更破壞了黏液-纖毛傳輸系統(tǒng)的功能，鼻腔、鼻竇黏膜防御功能減退，導(dǎo)致細菌更易定植，大量炎性介質(zhì)積聚，炎癥遷延不愈，因此，減少黏液分泌是治療慢性鼻竇炎的重要方法。但是目前，炎癥介質(zhì)對慢性鼻竇中黏液分泌的調(diào)控機制并不清楚。

近年來，對下呼吸道的研究發(fā)現(xiàn)，hCLCA1在黏蛋白MUC5AC的表達中發(fā)揮作用，與呼吸道黏液分泌有著非常密切的關(guān)系。Hoshino等［6］的研究結(jié)果顯示，hCLCA1存在于支氣管上皮，主要是存在于分泌黏液的杯狀細胞。體外和體內(nèi)實驗表明，IL-9、IL-13、TNF-α等通過上調(diào)hCLCA1介導(dǎo)MUC5AC的表達［7-9］。通過應(yīng)用hCLCA1抑制劑能有效抑制炎癥狀態(tài)下呼吸道上皮杯狀細胞MUC5AC的分泌［10-11］。上、下呼吸道黏膜的炎性反應(yīng)同屬一種病理生理機制且密切相關(guān)，提示hCLCA1在慢性鼻竇炎這類上呼吸道炎癥性疾病的病理機制中可能同樣發(fā)揮作用。因此本實驗檢測了hCLCA1在慢性鼻竇炎黏膜中的表達水平，探討了其與慢性鼻竇炎的關(guān)系。

本實驗免疫熒光結(jié)果顯示，hCLCA1蛋白在慢性鼻竇炎的篩竇黏膜中表達明顯增高，熒光染色強陽性，而健康對照組鼻竇黏膜中僅弱表達或無表達，熒光染色弱陽性或陰性。熒光染色半定量分析顯示，慢性鼻竇炎組陽性細胞面積比高于健康對照組。進一步的定量RT-PCR研究表明，hCLCA1 mRNA在慢性鼻竇炎鼻竇黏膜中也呈高表達，是健康對照組的49.7倍，說明hCLCA1蛋白和基因在鼻竇黏膜中的表達水平是一致的。這一結(jié)果提示，hCLCA1在慢性鼻竇炎的病理機制中可能發(fā)揮重要作用。

對各組鼻竇黏膜中hCLCA1蛋白熒光染色進行分析，hCLCA1主要位于上皮杯狀細胞，慢性鼻竇炎鼻竇黏膜細胞熒光染色呈強陽性，對照組染色呈弱陽性或陰性，而在上皮的其他細胞中未發(fā)現(xiàn)熒光染色，這與下呼吸道的研究結(jié)果一致［3，6］。結(jié)合慢性鼻竇炎病理形態(tài)特征，提示在慢性鼻竇炎鼻竇黏膜中hCLCA1的高表達可能與上皮杯狀細胞增生及黏液高分泌有關(guān)。在體外培養(yǎng)的慢性鼻竇炎鼻竇黏膜中，hCLCA1阻滯劑尼弗滅酸(NFA)對TNF-α誘導(dǎo)的MUC5AC表達具有抑制作用，提示hCLCA1在體外培養(yǎng)的慢性鼻竇炎鼻竇黏膜中是 TNF-α誘導(dǎo) MUC5AC表達的下游因素［12］。同樣，在體外培養(yǎng)的慢性鼻竇炎鼻竇黏膜組織塊中加入 Th2型細胞因子及 NFA，觀察 NFA阻斷hCLCA1對Th2型細胞因子誘導(dǎo)MUC5AC表達的影響，發(fā)現(xiàn)了同樣結(jié)果［13］。這 2項研究結(jié)果提示，hCLCA1可能在慢性鼻竇炎或變應(yīng)性鼻炎這類疾病中發(fā)揮同樣作用，即調(diào)控MUC5AC的表達。但未檢測hCLCA1在體內(nèi)的表達情況。本實驗從蛋白和基因水平對hCLCA1在慢性鼻竇炎鼻竇黏膜的表達和分布情況進行了研究，2種實驗結(jié)果證明，在慢性鼻竇炎中，hCLCA1的蛋白與基因表達均高于健康對照組的表達水平，提示hCLCA1可能在慢性鼻竇炎中的發(fā)病機制中發(fā)揮作用。

總之，通過本實驗觀察到，hCLCA1在慢性鼻竇炎鼻竇黏膜中有較強表達，其表達主要位于杯狀細胞中，表明hCLCA1在慢性鼻竇炎上皮杯狀細胞增生，黏液髙分泌的病理機制中可能具有重要意義，從而可能為治療慢性鼻竇炎“黏液髙分泌”提供新的治療靶點。

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