何 敏 趙長青 武耀紅 秦維山 杜玲珍

(山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院眼科，山西 太原 030001)

大鼠結(jié)膜杯狀細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定

何 敏 趙長青1武耀紅 秦維山 杜玲珍

(山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院眼科，山西 太原 030001)

目的 體外分離、培養(yǎng)大鼠結(jié)膜杯狀細(xì)胞，觀察其形態(tài)、結(jié)構(gòu)等生物學(xué)特征。方法 取大鼠穹隆部結(jié)膜，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中行組織塊培養(yǎng)，5～7 d后酶消化法傳代。觀察原代及傳代細(xì)胞的形態(tài)及生長情況，并應(yīng)用特殊免疫組化染色方法分別對(duì)原代、傳代培養(yǎng)的杯狀細(xì)胞進(jìn)行鑒定，用ImageJ軟件計(jì)算細(xì)胞純度。結(jié)果 倒置相差顯微鏡下可見杯狀細(xì)胞呈鵝卵石樣，5～7 d在組織塊周圍形成環(huán)狀結(jié)節(jié)。免疫組化結(jié)果顯示，培養(yǎng)的原代細(xì)胞角蛋白(CK)4染色陰性，CK7染色陽性，且CK7陽性細(xì)胞數(shù)占(97.3±2.0)%。傳代杯狀細(xì)胞中，絕大多數(shù)凝集素UEA-I染色為陽性，陽性細(xì)胞占(91.2±2.7)%。結(jié)論 大鼠穹窿部結(jié)膜可以成功培養(yǎng)出杯狀細(xì)胞，傳代細(xì)胞仍保持原代細(xì)胞特性，且純度較高。

結(jié)膜杯狀細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)

結(jié)膜上皮是構(gòu)成眼表的重要結(jié)構(gòu)，它不僅是眼表抵御外界環(huán)境干擾的一道屏障，而且對(duì)于維持眼表的健康、維持視覺質(zhì)量都起到重要作用。結(jié)膜上皮由復(fù)層鱗狀上皮細(xì)胞和杯狀細(xì)胞組成，它們除了可以分泌水和電解質(zhì)，還分泌黏蛋白。其中杯狀細(xì)胞分泌的大分子糖蛋白是淚膜的主要成分，也是構(gòu)成淚液中可溶性黏液的主要部分，對(duì)于維持眼表的健康意義重大。越來越多的實(shí)驗(yàn)證明，杯狀細(xì)胞不僅參與分泌黏蛋白，而且黏蛋白的分泌受到組胺、白介素、上皮生長因子等調(diào)節(jié)〔1～3〕，它已被認(rèn)為是一種免疫細(xì)胞，參與了眼表的免疫反應(yīng)〔4〕。因此對(duì)于杯狀細(xì)胞的研究已經(jīng)成為近年來研究的熱點(diǎn)。

對(duì)于結(jié)膜杯狀細(xì)胞體外培養(yǎng)的研究國外學(xué)者已有較多報(bào)道〔5～7〕，但國內(nèi)只有較少的學(xué)者對(duì)人和兔的結(jié)膜杯狀細(xì)胞進(jìn)行了研究〔8，9〕。因?yàn)槿说恼＝Y(jié)膜組織來源有限，因此本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)大鼠的結(jié)膜杯狀細(xì)胞進(jìn)行分離、培養(yǎng)、傳代及鑒定，為進(jìn)一步深入研究杯狀細(xì)胞的病理生理特性提供可靠的細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，出生后4～6 w，體重125～150 g，山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及所有實(shí)驗(yàn)得到了山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑 RPMI1640培養(yǎng)基來源于美國BioWhittaker公司，抗細(xì)胞角蛋白(CK)7鼠抗體來源于美國Santa Cruz生物技術(shù)公司，抗細(xì)胞CK4兔抗體來源于美國Abcam生物技術(shù)公司，交聯(lián)FITC的凝集素UEA-I來源于美國Pierce公司，胎牛血清來源于美國Hyclone公司。Cy3抗鼠IgG，Cy2抗兔IgG來源于美國Jackson ImmunoResearch公司。

1.3 方法

1.3.1 結(jié)膜杯狀細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及傳代 大鼠于CO2室箱內(nèi)約1～2 min后致死，斷頭，從雙眼取穹窿部結(jié)膜。將取下的組織放于盛有完全RPMI 1 640 培養(yǎng)基(包含10% 胎牛血清，2 mmol/L L-谷氨酰胺，100 μg/ml青鏈霉素，10 mmol/L Hepes緩沖液，1 mmol/L丙酮酸鈉，1%100×非必需氨基酸混合物)的塑料器皿中，于顯微鏡下將結(jié)膜下脂肪及筋膜組織剔除，并將其切割成1 mm×1 mm×1 mm大小組織塊，更換培養(yǎng)液后備用。取六孔板，每孔加0.5 ml的完全RPMI 1 640培養(yǎng)基。將分割好的結(jié)膜組織塊分散放于培養(yǎng)皿底部，每孔約8～10塊組織，然后放于37℃含95% O2、5% CO2的孵箱內(nèi)。48 h后，小心補(bǔ)充0.5 ml的培養(yǎng)基，防止組織塊松動(dòng)、漂浮。3 d后全量換液。

1.3.2 結(jié)膜杯狀細(xì)胞的傳代 5～7 d后，取出培養(yǎng)皿，在顯微鏡下用標(biāo)記筆標(biāo)出組織塊周圍的杯狀細(xì)胞，并用刮板將成纖維細(xì)胞刮除。吸出培養(yǎng)皿底部的組織塊及培養(yǎng)液，用PBS液清洗3次，每次約加入1 ml。然后室溫下加入1 ml Versene液8～10 min，以分散細(xì)胞。吸出Versene，每孔加入0.25 mol/L的胰蛋白酶1～1.5 ml，在37℃孵育箱內(nèi)放置約10 min。然后每孔加入完全培養(yǎng)液 1.5 ml，終止消化。用吸管反復(fù)輕柔吹打1～2 min。將混合液吸入50 ml離心管，用離心機(jī)1 000 r/min，離心10 min，吸除上清液，加入完全RPMI 1640培養(yǎng)液，反復(fù)吹打5 min，重懸細(xì)胞，然后接種于24孔或6孔板，每孔約0.5 ml或者1.0 ml，接種密度為每孔(5～10)×104。初始換液24～48 h，以后2～3 d換液一次。待細(xì)胞鋪滿80%后使用。

1.3.3 大鼠結(jié)膜杯狀細(xì)胞的鑒定

1.3.3.1 形態(tài)學(xué)檢查 在光學(xué)顯微鏡下觀察原代及傳代杯狀細(xì)胞的形態(tài)、大小、生長情況并進(jìn)行拍照。

1.3.3.2 原代杯狀細(xì)胞鑒定及純度分析 將大鼠結(jié)膜上皮組織塊直接種植在盛有載玻片的培養(yǎng)皿上原代培養(yǎng)，7 d后吸出培養(yǎng)液，用1×PBS液清洗1次，加入1 ml甲醇固定15～30 min，然后吸出甲醇，用1×PBS液漂洗3次。再加入2 ml 1×PBS液放于4℃冰箱保存待用。將固定好的載玻片取出，放于固定架上，浸于盛有1×PBS液的燒杯中，于搖床上清洗5 min。將載玻片放入 2%BSA 封閉液中，在搖床上輕搖30 min～2 h。 取出載玻片，將1∶100的含CK7 抗體和CK4抗體的0.2% BSA稀釋液浸滿載玻片表面，放置于濕盒內(nèi)于4℃冰箱孵育過夜。1∶100的含正常鼠的IgG抗體作為陰性對(duì)照組。取出載玻片，在搖床上用1×PBS液漂洗3次，每次10 min。制備新的BSA稀釋液，室溫下加入1∶300的Cy3和Cy2混合液孵育1 h(避光)。再用1×PBS液漂洗3次，用含有DAPI的封片劑封片。在暗箱內(nèi)風(fēng)干過夜，次日在熒光顯微鏡下觀察。選取組織塊和環(huán)狀細(xì)胞結(jié)節(jié)外圍之間3、6、9、12點(diǎn)鐘的等距位置，用ImageJ 1.48v軟件計(jì)算DAPI核染色陽性的總細(xì)胞數(shù)及CK7 和CK4 陽性細(xì)胞，并計(jì)算各自百分比。

1.3.3.3 傳代杯狀細(xì)胞的鑒定及純度分析 將消化后的細(xì)胞接種在盛有載玻片的培養(yǎng)皿上，然后固定(方法同上)。將1∶100的含CK7 抗體的稀釋液浸滿載玻片表面，1∶100的含正常鼠的IgG抗體作為陰性對(duì)照組，放置于濕盒內(nèi)于4℃冰箱孵育過夜。在1 ml稀釋液中加入2 μl UEA-I(與FITC熒光素共軛)抗體。600 μl上述UEA-I溶液加入2 μl Cy3(2抗)制備成Cy3混合液。孵育1 h(避光)。封片后熒光顯微鏡下觀察。隨機(jī)選取4個(gè)鏡下視野，用ImageJ 1.48v軟件計(jì)算DAPI核染色陽性的總細(xì)胞數(shù)、UEA-I 陽性細(xì)胞及CK7陽性細(xì)胞，并計(jì)算各自所占百分比。

2 結(jié) 果

2.1 杯狀細(xì)胞分離、生長及形態(tài) 在細(xì)胞培養(yǎng)的24 h內(nèi)，組織塊周邊可見有貼附的細(xì)胞。36～48 h后，鵝卵石樣的杯狀細(xì)胞清晰可見。在原代培養(yǎng)的5～7 d，杯狀細(xì)胞圍繞在組織塊周圍形成環(huán)形結(jié)節(jié)(圖1)。但并不是每一個(gè)組織塊都形成環(huán)形結(jié)節(jié)，在5 d左右的時(shí)間將未生長出細(xì)胞的結(jié)節(jié)去除，此外有些組織塊在生長至3～5 d時(shí)在環(huán)形結(jié)節(jié)的外圍可見有梭形的成纖維細(xì)胞。為了使細(xì)胞得以純化，這些成纖維細(xì)胞在傳代時(shí)需要被仔細(xì)刮除。杯狀細(xì)胞呈鵝卵石樣，大小相近，在顯微鏡下可見其表面有小滴，這是其分泌的黏蛋白。隨著杯狀細(xì)胞的增生，蛋白小滴也增多。當(dāng)細(xì)胞增生到一定程度后，即原代培養(yǎng)5～7 d后，用酶消化法傳代，傳代的細(xì)胞在形態(tài)上與原代相似。

圖1 大鼠穹隆結(jié)膜組織塊在含10%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)7 d后形成的環(huán)狀結(jié)節(jié)(×40)

2.2 原代杯狀細(xì)胞CK7和CK4鑒定及純度分析 培養(yǎng)的原代細(xì)胞CK4陰性、CK7染色陽性，證明培養(yǎng)的細(xì)胞為杯狀細(xì)胞(圖2)。對(duì)3個(gè)不同來源的結(jié)膜組織的標(biāo)本進(jìn)行染色計(jì)算，CK7陽性細(xì)胞占(97.3±2.0)%，CK4陽性細(xì)胞占(0.1±0.1)%。在正常老鼠IgG 陰性對(duì)照組中未見熒光染色陽性。

2.3 傳代細(xì)胞UEA-I和CK7鑒定及純度分析 對(duì)3個(gè)不同來源的結(jié)膜組織的標(biāo)本進(jìn)行染色計(jì)算，傳代培養(yǎng)的一代杯狀細(xì)胞中UEA-I染色陽性細(xì)胞占(91.2±2.7)%，CK7染色陽性細(xì)胞占(92.4±3.2)%，進(jìn)一步證明傳代后的杯狀細(xì)胞仍保留有原來的功能和特性，且具有較高純度。見圖3。

A.培養(yǎng)的細(xì)胞核被DAPI染為藍(lán)色;B.CK4 染色，陽性細(xì)胞胞漿中間絲染為綠色，但培養(yǎng)的細(xì)胞染色為陰性;C.CK7 染色，陽性細(xì)胞胞漿中間絲染為紅色;D.ABC融合后的圖像圖2 原代培養(yǎng)結(jié)膜杯狀細(xì)胞的鑒定(×200)

圖3 一代結(jié)膜杯狀細(xì)胞的鑒定(×400)

3 討 論

隨著環(huán)境及生活方式的改變，干眼、過敏性結(jié)膜炎等眼表疾病也越來越受到人們關(guān)注。其中，杯狀細(xì)胞在維持眼表的完整性及在眼表疾病免疫調(diào)節(jié)中的作用也開始被人們認(rèn)識(shí)。為了進(jìn)一步研究杯狀細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能以及它對(duì)于環(huán)境、物理、化學(xué)等因素影響的變化，需要我們建立一個(gè)優(yōu)質(zhì)的體外細(xì)胞模型。本實(shí)驗(yàn)研究取材于大鼠的上下穹窿部結(jié)膜，相對(duì)于球結(jié)膜和瞼結(jié)膜，穹窿部結(jié)膜的杯狀細(xì)胞增生能力更高〔10〕。使用加入L-谷氨酰胺、抗生素、小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基后，大鼠結(jié)膜的杯狀細(xì)胞可以在24 h內(nèi)就從穹窿結(jié)膜組織中分離出來，并增生形成環(huán)狀結(jié)節(jié)。因?yàn)楸瓲罴?xì)胞分泌黏蛋白，使得杯狀細(xì)胞與培養(yǎng)皿黏附緊密，因此在傳代時(shí)需要加入乙二胺四乙酸(Versense)，使得貼服的細(xì)胞更容易離散。培養(yǎng)5～7 d時(shí)有些組織塊的環(huán)形細(xì)胞結(jié)節(jié)周邊可見有梭形的成纖維細(xì)胞增生，因此在傳代過程中，要仔細(xì)刮除這些成纖維細(xì)胞，使細(xì)胞得以純化，實(shí)驗(yàn)證明傳代后的細(xì)胞仍然完整保留有杯狀細(xì)胞標(biāo)記和功能活動(dòng)，且純度較高。

CK是一種中間絲，它是一類存在于上皮細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)蛋白，具有極高的保守性和組織分化特異性，與上皮細(xì)胞的增殖分化密切相關(guān)。其中CK7是分泌性上皮細(xì)胞的標(biāo)志物，不僅是一些上皮惡性腫瘤細(xì)胞的標(biāo)記物，而且在正常組織中也是杯狀細(xì)胞的特異標(biāo)志〔11〕。CK4是復(fù)層鱗狀上皮細(xì)胞的標(biāo)志物，見于舌、會(huì)厭及食道上皮組織，在結(jié)膜組織中，它是非杯狀細(xì)胞的復(fù)層鱗狀上皮細(xì)胞的特異標(biāo)志〔12〕。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化染色，證明所培養(yǎng)細(xì)胞是結(jié)膜杯狀細(xì)胞。

凝集素UEA-I是一種高分子量的糖復(fù)合物，它是杯狀細(xì)胞分泌產(chǎn)物中糖蛋白上的L-巖藻糖，存在于細(xì)胞體內(nèi)，染色陽性表現(xiàn)為繞核分布的胞質(zhì)著色，呈囊泡狀〔13〕。我們發(fā)現(xiàn)，傳代的杯狀細(xì)胞的UEA-I及CK7陽性率均在90%以上，且形態(tài)和原代相似，進(jìn)一步表明經(jīng)過酶消化法傳代的杯狀細(xì)胞仍具有原代杯狀細(xì)胞的形態(tài)和特性，一般傳3～5代杯狀細(xì)胞形態(tài)及功能未發(fā)生改變，一代的杯狀細(xì)胞性狀更穩(wěn)定，常用于體外實(shí)驗(yàn)研究〔5〕，可以作為細(xì)胞模型用于進(jìn)行體外生物學(xué)研究。

本研究表明，選取大鼠的穹窿部結(jié)膜，可以分離和培養(yǎng)出結(jié)膜杯狀細(xì)胞，且消化傳代后的細(xì)胞仍然完整保留有杯狀細(xì)胞的標(biāo)記和功能，且純度較高，可以為今后進(jìn)一步研究杯狀細(xì)胞相關(guān)的眼表疾病提供有效的細(xì)胞模型。

1 Dartt DA，Hodges RR，Li D，etal.Conjunctival goblet cell secretion stimulated by leukotrienes is reduced by resolvins D1 and E1 to promote resolution of inflammation〔J〕.J Immunol，2011；186：4455-66.

2 Hodges RR，Bair JA，Carozza RB，etal.Signaling pathways used by EGF to stimulate conjunctival goblet cell secretion〔J〕.Exp Eye Res，2012；103(1)：99-113.

3 Hayashi D，Li D，Hayashi C，etal.Role of histamine and its receptor subtypes in stimulation of conjunctival goblet cell secretion〔J〕.Invest Ophthalmol Vis Sci，2012；53：2993-3003.

4 Dartt DA,Masli S.Conjunctival epithelial and goblet cell function in chronic inflammation and ocular allergic inflammation〔J〕.Curr Opin Allergy Clin Immunol，2014；14(4)：464-70.

5 Shatos MA，Rios JD，Tepavcevic V，etal.Isolation，characterization，and propagation of rat conjunctival goblet cells in vitro〔J〕.Invest Ophthalmol Vis Sci，2001；42：1455-64.

6 Shatos MA，Rios JD，Horikawa Y，etal.Isolation and characterization of cultured human conjunctival goblet cells〔J〕.Invest Ophthalmol Vis Sic，2003；44：2477-86.

7 Chung SH，Lee JH，Yoon JH，etal.Multi-layered culture of primary human conjunctival epithelial cells producing MUC5AC〔J〕.Exp Eye Res，2007；85(2)：226-33.

8 杜園園，蘇冠方，劉早霞,等.兔結(jié)膜杯狀細(xì)胞的無血清培養(yǎng)法〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2007；11：1096-7.

9 王志昕，鄧世靖，羅時(shí)運(yùn),等.正常人結(jié)膜杯狀細(xì)胞的體外培養(yǎng)〔J〕.眼科，2006；15(2)：172-6.

10 Eidet JR，F(xiàn)ostad IG，Shatos MA，etal.Effect of biopsy location and size on proliferative capacity of ex vivo expanded conjunctival tissue〔J〕.Invest Ophthalmol Vis Sci，2012；53：2897-903.

11 Krenzer KL，F(xiàn)reddo TF.Cytokeratin expression in normal human bulbar conjunctiva obtained by impression cytology〔J〕.Invest Ophthalmol Vis Sci，1997；38(1)：142-52.

12 Eidet JR，Utheim OA，Raeder S，etal.Effects of serum-free storage on morphology，phenotype，and viability of ex vivo cultured human conjunctival epithelium〔J〕.Exp Eye Res，2012；94(1)：109-16.

13 Fostad IG，Eidet JR，Shatos MA，etal.Biopsy harvesting site and distance from the explant affect conjunctival epithelial phenotype ex vivo〔J〕.Exp Eye Res，2012；104(1)：15-25.

〔2016-07-15修回〕

(編輯 徐 杰)

山西省回國留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目(2016-062)

1 山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院耳鼻喉科

趙長青(1961-)，男，教授，主任醫(yī)師，博士，主要從事變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病機(jī)制研究。

何 敏(1975-)，女，碩士，講師，主要從事眼表疾病及眼免疫研究。

R33

A

1005-9202(2017)07-1585-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.009