伍亞華，石亞中，吳珊珊

(蚌埠學(xué)院生物與食品工程系，安徽蚌埠233030)

產(chǎn)丁二酸桿菌誘變菌株的發(fā)酵特性及其代謝通量研究

伍亞華，石亞中，吳珊珊

(蚌埠學(xué)院生物與食品工程系，安徽蚌埠233030)

以產(chǎn)丁二酸桿菌為出發(fā)菌株，利用紫外線誘變，經(jīng)氟乙酸、丙烯醇兩種方法篩選突變株。研究了誘變菌株發(fā)酵時不同的發(fā)酵條件對發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量的影響及代謝通量。實驗表明，在CO2充足條件下，接種量為6%、搖床轉(zhuǎn)速為200r/min、發(fā)酵72h時，目標(biāo)產(chǎn)物丁二酸產(chǎn)量最高，達7.87g/L，而副產(chǎn)物的產(chǎn)量不高。代謝通量結(jié)果表明，原始菌株的葡萄糖利用率很低，經(jīng)過誘變篩選以后，丁二酸代謝通量提高了4.1%。

產(chǎn)丁二酸桿菌，發(fā)酵，代謝通量

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菌種 Actinobacillus succinogenes 130Z(ATCC 55618);斜面培養(yǎng)基 TSA培養(yǎng)基;發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖50，酵母提取物10，TSB 5，KH2PO41，(NH4)2SO42，MgCl20.5，NaCl 0.5，CaCO350;固體培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖10，酵母抽提物5，NaCl 1，MgCl2，CaCl21.5，Na2HPO40.46，NaH2PO40.27，MgCO310，瓊脂粉 14，pH7.2;氟乙酸平板培養(yǎng)基(g/L)TSA 33.4，氟乙酸5，調(diào)節(jié)pH 7.0左右，115℃滅菌20min;丙烯醇平板培養(yǎng)基(g/L)TSA 33.4，0.5%(W/V)丙烯醇，調(diào)節(jié) pH 7.0左右，115℃ 滅菌20min。

1.2 實驗方法

1.2.1 誘變篩選

1.2.1.1 氟乙酸平板誘變篩選 挑取適量已活化的原始出發(fā)菌株于9mL無菌水中混勻制成菌懸液，然后在紫外線下進行誘變3min，均勻涂布到氟乙酸各梯度平板上，35℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)48h。

1.2.1.2 氟乙酸－丙烯醇誘變篩選 挑取適量氟乙酸篩選得到的菌株于9mL無菌水中混勻制成菌懸液，然后在紫外線下進行誘變3min，均勻涂布到丙烯醇各梯度平板上，35℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)48h。

1.2.2 突變株搖瓶條件下發(fā)酵實驗 取Actinobacillus succinogenes誘變菌株進行搖床條件下的發(fā)酵。用無菌水洗下孢子，取1mL突變菌株孢子懸液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，置搖床32℃，一定條件下培養(yǎng)，發(fā)酵，測丁二酸產(chǎn)量。每個發(fā)酵條件用3個搖瓶平行實驗。發(fā)酵液過濾后用于測定丁二酸、乳酸、乙酸、甲酸、乙醇和葡萄糖含量。所有結(jié)果均取3次測定的平均值。

1.3 產(chǎn)物檢測

1.3.1 生物量測定 恒重法。

1.3.2 殘?zhí)菣z測 DNS法［13］。

1.3.3 發(fā)酵產(chǎn)物分析 用離子排斥 HPLC檢測［14］，Waters1512二元泵，Waters 2414RI檢測器，Breeze色譜工作站，Aminex HPX－87H離子色譜柱(300mm× 7.8mm，9μm)，流動相10mmol/L硫酸，柱溫55℃，流速0.5mL/min，進樣量10μL。

1.4 代謝通量分析

在菌株相關(guān)酶活分析及代謝產(chǎn)物精確檢測的條件下，結(jié)合丁二酸放線桿菌的主代謝途徑，推測其代謝過程，并利用擬穩(wěn)態(tài)假設(shè)的方法，可求出各個途徑的代謝通量。

根據(jù)Zeikus的研究建立代謝網(wǎng)絡(luò)［15］和代謝通量分析理論，假設(shè)所有中間代謝產(chǎn)物均滿足擬穩(wěn)態(tài)假設(shè)，得出質(zhì)盤平衡方程;如表1所示，包括12個反應(yīng)，其中涉及13個代謝通量，方程組的自由度為6，通過測定發(fā)酵液中的丁二酸、乳酸、乙酸、甲酸和葡萄糖的濃度，求得比摩爾濃度變化率，得到不同時間的菌體、丁二酸、乳酸、乙酸、甲酸的生成速率和葡萄糖的消耗速率，通過最小二乘法確定其他未知代謝通量［16］。

表1 生化反應(yīng)

表2 代謝通量方程及其他條件方程

2 結(jié)果與分析

2.1 Actinobacillus succinogenes的發(fā)酵研究

2.1.1 不同氣體條件對發(fā)酵產(chǎn)物的影響(發(fā)酵72h)

表3為Actinobacillus succinogenes在不同氣體條件下發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量。從表3可以看出，不同氣體條件下，Actinobacillus succinogenes的發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量有所不同。其中丁二酸產(chǎn)量受氣體條件影響較大，在二氧化碳充足時，丁二酸的產(chǎn)量最高，這對于培養(yǎng)Actinobacillus succinogenes有啟示作用。

發(fā)酵過程中的副產(chǎn)物乳酸、乙酸也受到氣體條件的影響，在N2充足時，產(chǎn)物乳酸和乙酸的產(chǎn)量較多，這可能是由于極端的厭氧條件所導(dǎo)致的。

表3 不同氣體條件下代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量(g/L)

CO2充足時，細胞可以發(fā)酵產(chǎn)生丁二酸以消耗還原力;當(dāng)氧氣充足時細胞可以通過三羧酸循環(huán)消耗的還原力促進細胞生長，當(dāng)細胞面臨極端的厭氧條件時，細胞內(nèi)的乳酸脫氫酶及乙醇脫氫酶作用，使還原力用來生成乳酸和乙醇，這樣可以保證細胞生長的順利進行。

2.1.2 CO2充足情況下不同發(fā)酵時間對發(fā)酵產(chǎn)物的影響 表4為在CO2充足情況下在不同的發(fā)酵時刻，Actinobacillus succinogenes主要發(fā)酵產(chǎn)物的比較。

表4 不同時間條件下發(fā)酵液成分對照表(g/L)

從表4可以看出，發(fā)酵72h時，丁二酸的產(chǎn)量相對較高，乳酸和乙醇的產(chǎn)量在一定的范圍內(nèi)隨發(fā)酵時間的延長而增加，而其他副產(chǎn)物甲酸、乙酸都比其他時刻要低。所以綜合上述因素，一般認為，對于Actinobacillus succinogenes發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸來說，72h是比較合適的發(fā)酵時間，此時，目標(biāo)產(chǎn)物丁二酸的產(chǎn)量較高，而副產(chǎn)物的產(chǎn)量不高。

2.1.3 接種量對發(fā)酵的影響(發(fā)酵72h) 圖1為發(fā)酵時間為72h條件下，接種量對發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量的影響。接種量的不同，使得搖瓶中的剩余空間不同，振蕩培養(yǎng)中的發(fā)酵液流體性質(zhì)也不同，因而是比較重要的影響因素。由圖1可知，在本實驗條件下，接種量與發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的量不存在正比關(guān)系，當(dāng)接種量為10%時，丁二酸產(chǎn)量最大，為8.84g/L，接種量增加時，產(chǎn)酸水平開始下降。

圖1 接種量對發(fā)酵產(chǎn)物的影響

2.1.4 搖床轉(zhuǎn)速對乳酸發(fā)酵的影響(發(fā)酵72h) 圖2為在為發(fā)酵時間為72h條件下?lián)u床轉(zhuǎn)數(shù)對產(chǎn)酸的影響。由圖2可知，搖床轉(zhuǎn)數(shù)對產(chǎn)酸影響較為顯著，其中200r/min對目標(biāo)產(chǎn)物丁二酸的產(chǎn)酸最為有利。轉(zhuǎn)速過小，搖瓶通氣量不足，影響發(fā)酵產(chǎn)物丁二酸的累積;轉(zhuǎn)速過大，丁二酸的累積量并沒有明顯變化。

圖2 搖床轉(zhuǎn)速對發(fā)酵產(chǎn)物的影響

2.2 代謝通量分析

在二氧化碳富集條件下，選取 Actinobacillus succinogenes及其氟乙酸誘變株和丙烯醇復(fù)合誘變株，發(fā)酵72h，測量發(fā)酵液中葡萄糖、甲酸、乳酸、乙酸、丁二酸和乙醇的比消耗速率，并根據(jù)代謝分析理論解出代謝方程，得出丁二酸發(fā)酵過程幾個關(guān)鍵步驟的代謝通量。

由圖3可以看出發(fā)酵中期細胞代謝通量值，對于原始出發(fā)菌株而言，葡萄糖的摩爾轉(zhuǎn)化率為31.8%，甲酸、乙酸、乙醇、乳酸的生成通量分別為25.4、25.3、23.0、6.8，處于較低的水平。

氟乙酸篩選菌株的丁二酸產(chǎn)量相對于原始菌株有所提高，一些副產(chǎn)物的量也有提高，特別是甲酸、乙醇的含量提高較為明顯，這可能是由于突變株中丙酮酸羧化酶較低造成了副產(chǎn)物的增加。氟乙酸丙烯醇復(fù)合篩選菌株的丁二酸產(chǎn)量有了很大的提高，并且乙醇的產(chǎn)量大幅度降低，乙醇通量相對降低，副產(chǎn)物減少，使得丁二酸的代謝通量提高了4.1%。

3 結(jié)論

Actinobacillus succinogenes發(fā)酵時，在CO2充足條件下，接種量為6%、搖床轉(zhuǎn)速為200r/min、發(fā)酵72h時，目標(biāo)產(chǎn)物丁二酸產(chǎn)量最高，達7.87g/L，而副產(chǎn)物的產(chǎn)量不高。通過對Actinobacillus succinogenes出發(fā)菌株、氟乙酸誘變株以及氟乙酸丙烯醇復(fù)合誘變株進行代謝通量分析，結(jié)果表明，原始菌株的葡萄糖利用率很低，經(jīng)過誘變篩選以后，葡萄糖的利用率有所提高，丁二酸產(chǎn)生通量提高了4.1%(此處代謝通量其實就是指碳代謝的流量，假定葡萄糖為100的情況下，轉(zhuǎn)化為丁二酸的轉(zhuǎn)化率越高，通量越大)，副產(chǎn)物在一定的程度上減少。

圖3 代謝網(wǎng)絡(luò)中的通量分布

［1］Zeikus JG，Jain MK，Elankovan P.Biotechnology of succinic acid production and markets for derived industrial products［J］. Appl Microbiol Biotechnol，1999，51:545－552.

［2］王金主，袁建國，王元秀，等.發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸的研究進展［J］.食品與藥品，2010，12(1):55－59.

［3］熊建春，周世水.高產(chǎn)琥珀酸菌株FA5誘變選育［J］.現(xiàn)代食品科技，2009，25(9):1080－1082.

［4］王慶昭，趙學(xué)明.琥珀酸發(fā)酵菌種研究進展［J］.生物工程學(xué)報，2007，23(4):570－576.

［5］Lee JW，Lee S Y，Song H，et al.The proteome of mannheimia succiniciproducens.a capnophilic rumen bacterium［J］. Proteomics，2006，6(12):3550－3566.

［6］Song H，Lee SY.Production of succinic acid by bacterial fermentation［J］.Enzyme Microbial Technol，2006，39:352－361.

［7］Lata A，Jasmine I，Rajendra K.Rapid screening procedures for identification of succinic acid producers［J］.J Biochem Biophys Methods，2005，63:24－32.

［8］Lee PC，Lee SY，Hong SH.Isolation and characterization of a new succinic acid － producing bacterium，Mannheimia succiniciproducens MBEL55E，from bovine lumen［J］.Appl Microbiol Biotechno1，2004，58:663－668.

［9］張洪勛，羅海峰，莊緒亮.琥珀酸發(fā)酵研究進展［J］.食品科學(xué)，2003(3):102－106.

［10］MichaelVGuetter，Denise RumLer，Mahendra KJain. Actinobacillus succinogenes sp.nov.，anovel succinic－acidproducing strain from the bovine rumen［J］.International Journal of Systematic Bacteriology，1999，49:207－216.

［11］Guettler MV，Denise RumLer，Mahendra KJ.Actinobacillus succinogenes sp.Nov.，a nove1 succinic－acid－producing strain from the bovine rumen［J］.Int J Syst Bacteriol，1999，49: 207－2l6.

［12］McKinlay JB，Zeikus JG，Vieille C.Insights into Actinobacillus succinogenes fermentative metabolism in a chemically defined growth medium［J］.Appl Environ Microbiol，2005，71(11):6651－6656.

［13］林加涵，魏文鈴，彭宣憲.現(xiàn)代生物學(xué)實驗［M］.北京:高等教育出版社，2001:69－71.

［14］劉宇鵬，鄭璞，孫志浩.采用離子排斥色譜法分析發(fā)酵液中的琥珀酸等代謝產(chǎn)物［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32(12): 119－123.

［15］沈菲.琥珀酸發(fā)酵條件的優(yōu)化與菌種選育［D］.天津:天津大學(xué)，2003.

［16］味之素株式公社.影響物質(zhì)生產(chǎn)代謝流量的測定方法［P］.中國:200480027263.6，2006－11.

Study on the fermentation condition of production succinic acid strains and metabolic flux analysis with ultraviolet induced

WU Ya－h(huán)ua，SHI Ya－zhong，WU Shan－shan
(Department of Biotechnology and Food Engineer in Bengbu College，Bengbu 233030，China)

Screening of high production succinic acid strains and metabolic flux analysis with ultraviolet were studied.The production of succinic acid of the wild strain was investigated under different gas conditions and fermentation time.Screening experiments of the wild strain were performed by using ultraviolet.It was found that the production of succinic acid of the mutant was measured to be 7.87g/L，which was higher than that of the wild strain，when culturing for 72h with enough CO2.Moreover，the yield of byproduct of the mutant was low.Results of metabolic flux analysis demonstrated that the utilization ratio of glucose of the mutant，compared to the wild strain，increased by 4.1%.

Actinobacillus succinogenes;fermentation;metabolic flux

TS201.3

A

1002－0306(2011)12－0233－04

丁二酸是一種二羧酸，為三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，同時也是厭氧代謝的發(fā)酵產(chǎn)物之一，在醫(yī)藥、食品、發(fā)酵、紡織等行業(yè)被廣泛的應(yīng)用［1－3］。當(dāng)前，大部分的丁二酸是通過化學(xué)法生產(chǎn)的。近年來，利用微生物菌種，以農(nóng)業(yè)產(chǎn)物玉米、木薯等為基本原料，發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸已成為有機酸發(fā)酵研究的熱門課題［1，4］。丁二酸作為三羧酸循環(huán)的中間體，也是許多嚴(yán)格厭氧菌和兼性厭氧菌累積產(chǎn)物［5－6］。產(chǎn)生丁二酸的微生物包括丙酸產(chǎn)生菌、典型的胃腸菌、瘤胃菌等［7－8］。Actinobacillus succinogenes是利用糖類物質(zhì)代謝產(chǎn)生丁二酸的瘤胃菌的代表［9－10］，是工業(yè)上生產(chǎn)丁二酸的一種高效菌種。Actinobacillus succinogenes發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的發(fā)酵產(chǎn)物為多種酸的混合物［11－12］。本研究以產(chǎn)丁二酸放線桿菌為出發(fā)菌株，利用紫外線對出發(fā)菌株進行誘變，通過氟乙酸、丙烯醇兩種方法篩選，獲得復(fù)合突變菌株，并對其發(fā)酵條件和代謝通量進行了研究。

2010－09－25

伍亞華(1972－)，男，講師，碩士研究生，研究方向:農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏專業(yè)。

蚌埠學(xué)院優(yōu)秀人才資助項目(蚌埠學(xué)院字［2008］2號)。