張新峰，王偉平，汪 蓉，王琛琛，陽(yáng) 飛，張華山，*

（1.發(fā)酵工程省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北工業(yè)大學(xué)，湖北武漢430068；2.湖北大學(xué)知行學(xué)院，湖北武漢430011）

嗜熱真菌發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶培養(yǎng)基的優(yōu)化及部分酶學(xué)性質(zhì)的研究

張新峰1，王偉平1，汪 蓉2，王琛琛1，陽(yáng) 飛1，張華山1，*

（1.發(fā)酵工程省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北工業(yè)大學(xué)，湖北武漢430068；2.湖北大學(xué)知行學(xué)院，湖北武漢430011）

采用響應(yīng)面法對(duì)嗜熱真菌發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化以及對(duì)該酶液的基本性質(zhì)進(jìn)行研究。首先對(duì)初始培養(yǎng)基中的8種影響因素進(jìn)行Plackett-Burman設(shè)計(jì)，篩選出3種重要影響因素，即玉米芯、尿素和KH2PO4；再利用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)為中心組合實(shí)驗(yàn)確定最大響應(yīng)區(qū)間，最后經(jīng)響應(yīng)面分析獲得最優(yōu)化結(jié)果：玉米芯濃度為4.570%（w/v），尿素濃度為1.797%（w/v），KH2PO4濃度為0.497%（w/v），酶活提高了18%。該酶對(duì)玉米芯為底物的專(zhuān)一性較好，最適酶促反應(yīng)溫度為65℃且在該溫度下較穩(wěn)定，最適反應(yīng)pH為6.8，并且pH穩(wěn)定性較好。

嗜熱真菌，木聚糖酶，優(yōu)化，酶學(xué)性質(zhì)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗜熱真菌T-U-03-10（Thermomyces lanuginosusT -U-03-10） 為湖北工業(yè)大學(xué)生工樓207實(shí)驗(yàn)室保藏菌種；斜面活化培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基；產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基 玉米芯3.0%，尿素2.0%，KH2PO40.5%，ZnSO40.2%，MgSO4·7H2O 0.03%，CaCl20.03%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03%，吐溫-80 0.03%，pH6.5，于121℃滅菌30min；可溶性淀粉，羧甲基纖維素鈉，中華一號(hào)濾紙，pH6.5磷酸緩沖液，0.1mol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（pH4.0～8.0），0.05mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（pH9.0～10.0），DNS溶液[4]，其他藥品均為分析純。

DNP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；THZ-82恒溫水浴振蕩器 常州諾基儀器有限公司；TGL-16C臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭離心機(jī)；ZHWY-2102C恒溫?fù)u床 上海智城分析儀制造有限公司；Delta320pH計(jì) 梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 搖瓶培養(yǎng)條件 將2cm2見(jiàn)方的平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)2.5～3d的菌絲體接入裝有80mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于50℃下，轉(zhuǎn)速180r/min振蕩培養(yǎng)7d。

1.2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化

1.2.2.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選重要影響因素 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析均采用SAS-JMP軟件。在前期單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，采用N=12的PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表，考察發(fā)酵培養(yǎng)基中的8個(gè)因數(shù)，分別為玉米芯（X1）、尿素（X2）、KH2PO4（X3）、（NH4）2SO4（X4）、MgSO4·7H2O（X5）、CaCl2（X6）、FeSO4·7H2O（X7）、吐溫-80（X8），每個(gè)因素取兩個(gè)水平，木聚糖酶活（Y）作為響應(yīng)值。

1.2.2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析得出顯著因素后，再依據(jù)各顯著因素的正負(fù)效應(yīng)來(lái)確定最陡爬坡實(shí)驗(yàn)的路徑（包括變化方向和步長(zhǎng)），以便找出峰值，從而快速逼近最大響應(yīng)區(qū)域。

1.2.2.3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)PB實(shí)驗(yàn)和爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍然采用SAS-JMP軟件進(jìn)行分析。

1.2.2.4 酶活的測(cè)定 取適量的發(fā)酵液經(jīng)高速離心（8000r/min，5min），取上清液即為所得粗酶液，進(jìn)行適當(dāng)稀釋后測(cè)定酶活力[5]。

1.2.3 木聚糖酶粗酶液酶學(xué)性質(zhì)的研究

1.2.3.1 粗酶液的制備 采用優(yōu)化后的發(fā)酵工藝條件制備產(chǎn)酶發(fā)酵液，然后在6000r/min下離心5min，取上清液即為粗酶液。

1.2.3.2 不同底物對(duì)酶活的影響[6]將0.500g木聚糖、0.500g羧甲基纖維素鈉、0.500g可溶性淀粉分別用100mL 0.1mol/L pH6.8檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液配制為0.5%的底物溶液，長(zhǎng)寬比為2×1cm濾紙也加入上述緩沖液，再分別加入稀釋好的酶液反應(yīng)，測(cè)定酶活。以木聚糖為底物測(cè)得酶活定義為100%，其他底物測(cè)得酶活均換算為相對(duì)酶活。

1.2.3.3 最適酶促反應(yīng)溫度的確定 將0.5%木聚糖溶液分別在45、50、55、60、65、70、75℃下預(yù)熱2min，然后加入一定量稀釋好的粗酶液在相應(yīng)的溫度下測(cè)定酶活。測(cè)定三次求平均值，將最高的酶活力定義為100%，分別計(jì)算不同溫度下木聚糖酶的相對(duì)酶活力。1.2.3.4 酶的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將稀釋后的酶液分別置于55、60、65、70℃保溫不同的時(shí)間后，立即冷卻，然后于60℃下測(cè)定酶活力，測(cè)定三次求平均值，未經(jīng)保溫處理測(cè)得酶活力定義為100%，分別計(jì)算溫浴不同時(shí)間后的殘余酶活。

1.2.3.5 最適酶促反應(yīng)pH的確定 分別采用0.1mol/L（pH4.0～8.0）檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液和0.05mol/L（pH9.0～10.0）甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液配制0.5%木聚糖作為底物，與稀釋后酶液反應(yīng)，測(cè)定酶活。測(cè)定三次求均值，將最高的酶活定義為100%，分別計(jì)算不同pH條件下酶的相對(duì)酶活力。

1.2.3.6 最適pH酶的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將粗酶液添加到最適pH緩沖液中，室溫下保持不同時(shí)間（0、1、2、3h、4、5、6h），測(cè)定酶活。測(cè)定三次求均值，將0h酶活定義為100%，分別計(jì)算保持不同時(shí)間的相對(duì)酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化 用SAS-JMP軟件設(shè)計(jì)的Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)回歸分析見(jiàn)表2。由表2結(jié)果分析可知，培養(yǎng)基的顯著因素依次為尿素、KH2PO4、玉米芯，它們的可信度均大于90%。其中，玉米芯、KH2PO4濃度對(duì)產(chǎn)酶為正效應(yīng)，而尿素濃度對(duì)產(chǎn)酶為負(fù)效應(yīng)。為了提高產(chǎn)酶量，應(yīng)逐步提高玉米芯、KH2PO4濃度和降低尿素濃度。其他因素對(duì)產(chǎn)酶影響不大，為此濃度不變。

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)回歸分析結(jié)果

2.1.2 中心實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的確定 由表3可知，隨著尿素、KH2PO4、玉米芯的變化，酶活先上升后下降。當(dāng)玉米芯濃度為4.5%，尿素濃度為1.8%，KH2PO4為0.5%時(shí)，酶活達(dá)到最大，即以此為實(shí)驗(yàn)優(yōu)化中心點(diǎn)，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

表3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果

2.1.3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化 以玉米芯、尿素和KH2PO4為顯著因素，因素水平如表4所示，Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表5所示。

表4 Box-behnken設(shè)計(jì)因素水平表

表5 Box-behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

應(yīng)用SAS-JMP軟件對(duì)表5實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行最小二乘擬合，得到模型如下：

圖1 實(shí)際值對(duì)預(yù)測(cè)值的模型擬合圖

表6 回歸方程的方差分析

由圖1實(shí)際值對(duì)預(yù)測(cè)值的模型擬合和表6回歸方程的方差分析可知，P=0.0011＜α=0.05，則該模型顯著，模型擬合度R2=0.98，說(shuō)明該模型在一定程度上反映響應(yīng)值的變化，擬合度較高。失擬合不顯著（P= 0.2074）則表明誤差是由不可避免的隨機(jī)誤差引起的。

用JMP繪制三維立體響應(yīng)曲面圖，見(jiàn)圖2。

圖2 各因素對(duì)木聚糖酶活影響的響應(yīng)面圖

通過(guò)SAS-JMP軟件對(duì)圖2分析得出，當(dāng)X1= 0.0467182，X2=-0.078431，X3=-0.030674，即玉米芯濃度為4.570%，尿素濃度為1.797%，KH2PO4濃度為0.497%時(shí)，響應(yīng)值Y達(dá)到最大，即木聚糖酶活為1645.29U/mL。

2.1.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為了準(zhǔn)確地檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的可靠性，在培養(yǎng)基最佳優(yōu)化條件下，進(jìn)行5組平行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，所測(cè)得酶活分別為1640.10、1642.60、1645.84、1646.71、1644.68U/mL，平均酶活力為1643.99U/mL，與模型預(yù)測(cè)值基本一致，表明該模型能很好地預(yù)測(cè)實(shí)際發(fā)酵產(chǎn)酶情況，并且與優(yōu)化前的酶活1393.0U/mL相比提高了18.0%。

2.2 酶學(xué)性質(zhì)的研究

2.2.1 不同底物對(duì)酶活的影響 添加不同底物對(duì)酶活的影響結(jié)果如表7所示。

表7 木聚糖酶的底物專(zhuān)一性

由表7可見(jiàn)，該木聚糖酶對(duì)羧甲基纖維素鈉和濾紙的酶活性很低，甚至對(duì)可溶性淀粉沒(méi)有酶活性，說(shuō)明該突變菌株產(chǎn)的木聚糖酶對(duì)底物的專(zhuān)一性較好，有利于應(yīng)用半纖維素降解。

2.2.2 最適酶促反應(yīng)溫度的確定 該酶分別在不同溫度下測(cè)得酶活，結(jié)果如圖3所示。

圖3 溫度對(duì)酶促反應(yīng)的影響

由圖3可見(jiàn)，酶活隨溫度的變化趨勢(shì)為先升高后降低。在55℃以下及70℃以上酶活力變化幅度較大，如在45℃和75℃時(shí)，酶活力水平分別降到30.06%和44.80%；當(dāng)溫度在60～70℃時(shí)，酶活變化幅度較小，且均保持在85%以上。為此，確定最適酶促反應(yīng)溫度為65℃。

2.2.3 酶的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將木聚糖酶和底物的混合物分別在55、60、65、70℃溫浴60min，每隔10min測(cè)一次酶活，結(jié)果見(jiàn)圖4。

如圖4所示，在55～65℃條件下，保溫時(shí)間對(duì)該酶活的影響不明顯，保溫40min后剩余酶活力均在80%以上，不過(guò)，酶活力隨時(shí)間延長(zhǎng)均有緩慢降低的趨勢(shì)。但當(dāng)溫度達(dá)到70℃以上時(shí)，酶活隨時(shí)間下降的幅度較大。說(shuō)明該酶適合在65℃下進(jìn)行酶解反應(yīng)，更有利于應(yīng)用于制漿漂白工藝和半纖維素降解工業(yè)中。

圖4 酶的熱穩(wěn)定性

2.2.4 最適酶促反應(yīng)pH的確定 采用不同pH的緩沖液來(lái)配制酶解反應(yīng)體系，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 pH對(duì)酶促反應(yīng)的影響

圖5的結(jié)果表明，T-U-03-10所產(chǎn)木聚糖酶的pH作用范圍較寬，在pH5.0～8.0范圍內(nèi)酶活均大于70%，不過(guò)最適酶促反應(yīng)溫度在pH6.8左右，說(shuō)明該酶較適合在中性條件下進(jìn)行反應(yīng)。但在堿性條件下，酶極易失活，說(shuō)明該酶的耐堿性差而耐酸性較好，比較適合半纖維素降解環(huán)境。

圖6 處理時(shí)間對(duì)酶活的影響

2.2.5 最適pH酶的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將酶液與木聚糖置于pH為6.8檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖體系中處理不同時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)圖6。

由圖6可見(jiàn)，該酶在pH為6.8時(shí)相當(dāng)穩(wěn)定，在保持4h后酶活仍有90%以上，且在6h后酶活還有85.20%。說(shuō)明該酶在最適pH下穩(wěn)定性較好，有利于為后續(xù)的半纖維素酶解反應(yīng)提供酸堿的穩(wěn)定性。

3 討論

應(yīng)用微生物發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶水解植物半纖維素制備低聚糖[7-9]已被各大生產(chǎn)企業(yè)所采用，但由于存在酶活力不高導(dǎo)致菌種選擇范圍較窄，以及酶的專(zhuān)一性不強(qiáng)、水解溫度不高、反應(yīng)速度慢等造成低聚糖的后續(xù)分離純化困難、生產(chǎn)周期長(zhǎng)等不利因素，為此，本實(shí)驗(yàn)從培養(yǎng)基優(yōu)化著手來(lái)提高酶活，同時(shí)又對(duì)該酶學(xué)的部分性質(zhì)進(jìn)行了初步的探討。

本實(shí)驗(yàn)是在前期實(shí)驗(yàn)單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，對(duì)培養(yǎng)基中已確定的8種因素利用響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化，以便獲得最佳的優(yōu)化結(jié)果，從而進(jìn)一步提高酶活。最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基為：玉米芯濃度為4.570%，尿素濃度為1.797%，KH2PO4濃度為0.497%，ZnSO40.2%，MgSO4·7H2O 0.03%，CaCl20.03%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03%，吐溫-80 0.03%，從而酶活由1393U/mL提高到1644 U/mL，優(yōu)化后達(dá)到了比較好的效果。該菌產(chǎn)的木聚糖酶對(duì)底物的專(zhuān)一性較強(qiáng)，以玉米芯為底物最好；酶的最適反應(yīng)溫度為65℃且穩(wěn)定性較好；最適pH為6.8，pH穩(wěn)定性較好，而其他一些性質(zhì)包括金屬離子、有機(jī)溶劑對(duì)酶性質(zhì)的影響以及動(dòng)力學(xué)反應(yīng)參數(shù)值Km和Vmax測(cè)定有待進(jìn)一步摸索。因此，根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，初步預(yù)測(cè)嗜熱真菌T-U-03-10液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)的木聚糖酶，適合用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)低聚木糖的制備。

[1]陳紅歌，郭夏麗，竇會(huì)娟，等.黑曲霉M1菌株木聚糖酶復(fù)合酶的固態(tài)發(fā)酵條件及其酶學(xué)性質(zhì)研究 [J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2002，29（4）:33-36.

[2]畢瑞明，孫迅，任少亭.黑曲霉產(chǎn)木聚糖酶發(fā)酵條件的研究[J].工業(yè)微生物，2000，30（1）:53-55.

[3]Bezerra MA，Santelli RE，Oliveira EP，et al.Responsesurface methodology（RSM）as a tool for optimization inanalytical chemistry[J].Talanta，2008，76（5）:965-977.

[4]李彩霞，房桂干，劉書(shū)釵.木聚糖酶酶活的具體測(cè)定方法[J].林產(chǎn)化工通訊，2001，35（1）:20-23.

[5]農(nóng)旭華，張繼泰，王玉瑛，等.嗜熱真菌DSM10635生產(chǎn)耐熱木聚糖酶的小試研究[J].工業(yè)微生物，2009（3）:62-66.

[6]張?jiān)?黑曲霉木聚糖酶固體發(fā)酵及酶學(xué)特性的研究[D].東北師范大學(xué)碩士學(xué)位論文，2008:21-22.

[7]Yasushi Mitsuishi，et al.The modes of action of three xylanase from Mesophilic Fungusstrain Y-94 on xylooligosaccharides[J]. Agric Biol Chem，1988（52）:921-927.

[8]徐勇，陳牧，余世袁，等.木聚糖酶水解制取低聚木糖的研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2002，22（2）:57-60.

[9]楊瑞金，許時(shí)嬰，王璋.酶活生產(chǎn)低聚木糖過(guò)程中纖維素和木聚糖-木質(zhì)素復(fù)合物結(jié)構(gòu)的變化[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2001，16（6）:43-46.

Optimization of fermentation medium for thermophilic fungal xylanase and study on some enzymatic properties

ZHANG Xin-feng1,WANG Wei-ping1,WANG Rong2,WANG Chen-chen1,YANG Fei1,ZHANG Hua-shan1,*
（1.Key Laboratory of Fermentation Technology,Ministry of Education,Hubei University of Technology,Wuhan 430068，China；2.Zhixing College of Hubei University，Wuhan 430011，China）

Fermentation medium of thermophilic fungal for xylanase production was optimized by response surface method and the basic properties of the enzyme solution were studied.First，eight kinds of factors of the initial medium was adopted by the Plackett-Burman design，and selected three kinds of important factors，namely，corn cob，urea and KH2PO4，and then the path of steepest ascent was adopted for the central composite experiment to determine the maximum response interval.Finally response surface optimization results was obtained，corncob 4.570%(w/v)，urea 1.797%(w/v)，KH2PO40.497%(w/v)，therefore，enzyme activity was increased by 18%.The enzyme pecificity was better，corncob being regard as substrate，the optimal enzyme reaction temperature was 65℃ and the temperature was more stable，the optimum pH 6.8 and pH stability was better.

ThermophiIic fungi；xylanase；optimization；enzymatic properties

TS201.2

A

1002-0306（2011）10-0249-04

木聚糖酶是一種復(fù)合酶系，包括β-1，4-木聚糖酶和β-木糖苷酶[1]，專(zhuān)一用于木聚糖的降解。木聚糖酶對(duì)自然界中存在的大量半纖維素也起著重要的降解作用，該酶還廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、飼料添加劑等方面，已受到廣泛的關(guān)注[2]。由于該菌株產(chǎn)木聚糖酶活力不是很高，本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基來(lái)提高其產(chǎn)酶能力。響應(yīng)面法[3]（response sur face methodology，RSM）是采用合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并通過(guò)實(shí)驗(yàn)獲得一定數(shù)據(jù)，再用多元二次方程來(lái)擬合因素和響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，最后對(duì)回歸方程的分析來(lái)尋求最佳優(yōu)化工藝，從而解決多變量問(wèn)題的一種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。為了更好地應(yīng)用該酶來(lái)降解半纖維素制備低聚木糖，對(duì)酶的部分性質(zhì)做了初步的研究，以便于找到最適的水解條件。

2010-09-17 *通訊聯(lián)系人

張新峰（1983-），男，在讀研究生，研究方向：發(fā)酵工程。