溫海燕 （菏澤學(xué)院動物科學(xué)系 山東 菏澤 274015）

?

豬傳染性胃腸炎病毒Sa 基因的克隆與序列分析

溫海燕 （菏澤學(xué)院動物科學(xué)系 山東 菏澤 274015）

將豬傳染性胃腸炎病毒接種ST細(xì)胞進(jìn)行增殖，待細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病變后，將細(xì)胞反復(fù)凍融3次收獲病毒。根據(jù)GenBank中已發(fā)表的豬傳染性胃腸炎病毒S基因的序列，設(shè)計合成了1對擴(kuò)增S基因包含A抗原位點(diǎn)724bp基因片段(Sa)的引物，引物兩端分別有HⅠ和dⅢ的酶切位點(diǎn)。以感染細(xì)胞提取的病毒RNA為模板，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增得到目的片段，然后將其克隆到pMD18-T載體上，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和酶切鑒定選擇陽性克隆進(jìn)行序列測定，構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-Sa。用DNAstar軟件將其與GenBank上的序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明，核苷酸同源性為97%以上，氨基酸同源性為93%以上。根據(jù)豬傳染性胃腸炎病毒Sa基因核苷酸序列繪制的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明，試驗(yàn)株與TH-98株親緣性最近。

胃腸炎病毒 Sa基因 克隆 序列分析

豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)隸屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，是引起仔豬病毒性腹瀉的重要病原，由其引起的豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis of swine,TGE)是一種急性、高度接觸性腸道傳染病，是世界動物衛(wèi)生組織(OIE)法典中B類疫病中必檢的豬傳染病。不同年齡和品種的豬均易感，尤其以仔豬最易感，2周齡以內(nèi)的仔豬致死率高達(dá)100%，以嘔吐、腹瀉、脫水、高死亡率為典型癥狀，成年豬死亡率較低，但是會造成機(jī)體消瘦，降低飼料利用率等[1]。目前該病已遍布全世界各國，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

TGEV由4種結(jié)構(gòu)蛋白和3種非結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成，其中S蛋白為大的糖蛋白，形成病毒突起，攜帶主要的B淋巴細(xì)胞抗原決定簇，是唯一能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體和提供免疫保護(hù)作用的結(jié)構(gòu)蛋白；含有宿主細(xì)胞氨肽酶受體(PAPN)的識別位點(diǎn)，在決定宿主細(xì)胞親嗜性方面起關(guān)鍵作用[2]。S基因長度為4.35×103bp，包括A、B、C、D4個位點(diǎn)，其中A位點(diǎn)又可分為Aa、Ab、Ac 3種亞位點(diǎn)，A位點(diǎn)暴露于病毒的表面，主要誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生，并且不同分離株的A位點(diǎn)保守性強(qiáng)[3,4]。

目前國際上已培育多種弱毒疫苗，有德國的BI-30疫苗株，匈牙利的CKP弱毒株，美國的TGE-Vac株等等，國內(nèi)哈爾濱獸醫(yī)研究所也培育成功華株弱毒疫苗[5]。弱毒株大多是經(jīng)不同方式的人工致弱而成，一般的弱毒疫苗均有一定的殘余毒力與致病性，在動物體內(nèi)增殖誘發(fā)免疫力的同時又有毒力返強(qiáng)的可能。而滅活疫苗接種后雖能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生比弱毒疫苗更高的循環(huán)抗體，但因機(jī)體缺乏局部的黏膜免疫，不能有效地抵抗外界野毒的侵襲[6]。鑒于此，本研究對豬傳染性胃腸炎病毒Sa基因進(jìn)行克隆與序列分析，為豬傳染性胃腸炎病毒新型基因工程疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 1640培養(yǎng)基(購自美國HyClone公司)，新生牛血清購自上海華美公司、Taq DNA聚合酶、TAKARADNA Fragment Purification Kit 、DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn) DL2000、限制性內(nèi)切酶HⅠ和dⅢ、T4DNA 連接酶、膠回收純化試劑盒購自大連寶生物工程有限公司，X-gal、IPTG購自Merk 公司、DEPC購自Sigma公司、胰蛋白胨和酵母提取物購自O(shè)XOID公司，ST細(xì)胞、DH5α、豬傳染性胃腸炎病毒均有傳染病實(shí)驗(yàn)室保存，pMD18-T Vector購自大連寶生物工程有限公司。

1.2 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的基因序列，應(yīng)用Primer5.0軟件自行設(shè)計合成了一對能擴(kuò)增724bp基因片段(包括S基因A抗原位點(diǎn))的引物，兩端分別含有HⅠ和dⅢ的酶切位點(diǎn)及保護(hù)性堿基，序列：P1：5’ACGTCA TTG AAC ACA ACG GGT GGT GTC 3’HⅠ；P2：5’ AGCCTG TGG CAT CTA AAA CGT CCG T3’dⅢ。送北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。

1.3 病毒RNA的抽提 將病毒液接種到ST單層細(xì)胞上，72h后，待細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，將細(xì)胞反復(fù)凍融三次。10000rpm離心10min，取上清，獲得的病毒液參照Trizol(一步法總RNA提取試劑)試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4 RT-PCR （1）cDNA的合成參照M-MLV Reverse Transcriptase 說明按下列體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：RNA模板1μl，0.5μl下游引物P2，9μl RNase Free H2O，70℃溫浴5min結(jié)束后立即放在冰上。繼續(xù)添加4μl 5×M-MLV RTase buffer，2μl 100Mmdtt，2μl dNTP(2.5mM)，0.5μl RNase inhibitor，1μl M-MLV RTase，37-42℃溫浴1h，得到的反應(yīng)液可立刻用于PCR反應(yīng)或－20℃保存?zhèn)溆?。?）Sa基因的PCR擴(kuò)增。按常規(guī)方法進(jìn)行PCR反應(yīng)，冰上操作，采用25μl體系，PCR 管中依次加入以下試劑：3μl cDNA模板，2.5μ1 0×PCR Buffer，0.5μl上游引物P1(20pmoL/μl)，0.25μl Taq DNA聚合酶(5U/μl)，18.75μl ddH2O，優(yōu)化后的PCR反應(yīng)條件：94℃ 5min，94℃ 1min、69.4℃ 1min、72℃ 1min進(jìn)行30個循環(huán)，72℃10min。PCR結(jié)束后，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，觀察結(jié)果。

1.5 目的片段的回收、純化及序列測定 參照超薄瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明回收純化目的片段，然后將其與pMD18-T載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，挑斑，擴(kuò)大培養(yǎng)，抽提重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和PCR鑒定，將鑒定為陽性克隆的菌液送寶生物(大連)有限公司測序。

1.6基因序列分析 利用DNAstar 軟件對所測定的基因的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行編輯，并與GenBank中的序列進(jìn)行同源性比較，然后用ProtScale軟件對編碼的Sa蛋白的空間進(jìn)行模擬分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 TGEV Sa基因的RT-PCR擴(kuò)增 以TGEV RNA為模板，應(yīng)用引物P2，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，以P1和P2為引物擴(kuò)增Sa基因，所獲得的PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠電泳上呈單一條帶，大小與預(yù)期724bp相符(圖1)。

2.2 質(zhì)粒的雙酶切鑒定 重組質(zhì)粒經(jīng)HⅠ和dⅢ雙酶切后，得到約760bp的插入片段和約2656bp的載體片帶，證明所挑取的克隆為正確的重組轉(zhuǎn)化子，將得到的重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-Sa(圖2)。

2.3 重組質(zhì)粒的PCR鑒定 將重組質(zhì)粒pMD18-T-Sa轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，獲得大量轉(zhuǎn)化子。從中隨機(jī)挑選幾個重組子單菌落，用PCR方法進(jìn)行鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，以引物P1和P2擴(kuò)增出了大小為724bp的特異片段，表明所檢測的克隆中均含有外源目的片段的插入(圖3)。

圖1 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1-2：RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 重組質(zhì)粒pMD18-T-Sa雙酶切鑒定結(jié)果

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1-2：雙酶切鑒定結(jié)果

圖3 重組質(zhì)粒pMD18-T-Sa PCR鑒定

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1-2：重組質(zhì)粒pMD18-T-Sa PCR 鑒定

2.4 Sa基因的序列測定及分析 將疑似陽性克隆的菌液送寶生物(大連)公司進(jìn)行測序，用DNAstar軟件將測定序列與GenBank中的序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明：試驗(yàn)株Sa基因與GenBank中毒株TH-98、HN2002、SC-Y、133、TS的基因核苷酸同源性分別為99.3%、97.9%、99.6%、97.7%、97.9%，氨基酸同源性分別為97.9%、95.0%、98.8%、93.8%、95.0% (表1)，再根據(jù)它們的核苷酸序列繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)，結(jié)果表明：試驗(yàn)株與TH-98毒株在進(jìn)化上親緣關(guān)系最近，最后利用DNAstar軟件對Sa片斷的抗原表位進(jìn)行分析，由圖可見第178-231(即S基因A位點(diǎn))位點(diǎn)抗原性好(圖5)。

表1 不同病毒株Sa基因的核苷酸及氨基酸同源性比較(%)

注：*表示同源性為100%

3 討論

（1）豬傳染性胃腸炎病毒感染具有明顯的腸嗜性，病毒粒子表面的纖突蛋白(S蛋白)與存在于腸上皮細(xì)胞頂膜的氨基肽酶(APN)的結(jié)合是感染發(fā)生的首要條件，因此，S蛋白是免疫預(yù)防和診斷研究的重點(diǎn)。TGEV只有1個血清型，而變異卻使TGEV各毒株之間產(chǎn)生了抗原差異。彭樹英等[7]將TSX毒株S全基因序列與其他毒株相比，雖在核酸和氨基酸序列上存在一定差異，但形成4個抗原位點(diǎn)的核酸和氨基酸序列并未發(fā)生變異，Aa、Ab、Ac位點(diǎn)仍高度保守，并且A位點(diǎn)的缺失可導(dǎo)致S蛋白喪失產(chǎn)生中和抗體的能力。因此，本研究設(shè)計引物擴(kuò)增了一段包含TGEV S基因A位點(diǎn)的片段，為豬傳染性胃腸炎基因工程疫苗的研制奠定了良好基礎(chǔ)。（2）TGEV病毒通過消化道進(jìn)入仔豬體內(nèi)，其靶細(xì)胞都是腸絨毛上皮細(xì)胞，引起腸絨毛的萎縮脫落，導(dǎo)致動物消化紊亂、酸中毒和脫水。在預(yù)防上，如果在腸腔內(nèi)經(jīng)常有抗體存在，就可以不斷中和豬體攝入的病毒，從而起到保護(hù)作用。因此，黏膜免疫是本病特異性免疫應(yīng)答的主要特征，而腸道黏膜表面SIgA含量的高低直接決定臨床疾病的發(fā)生和疾病嚴(yán)重程度[8]。針對本病的特點(diǎn)，采用口服免疫是較為理想的預(yù)防途徑，口服免疫突出的優(yōu)點(diǎn)是可有效地刺激腸道局部免疫細(xì)胞產(chǎn)生SIgA，尤其適應(yīng)于腸道黏膜傳染病，而探索安全、有效、廉價、可以誘導(dǎo)黏膜免疫產(chǎn)生的新型疫苗顯得尤為重要。本試驗(yàn)成功地克隆得到了TGEV Sa基因，結(jié)合枯草芽孢桿菌基因的功能特點(diǎn)，構(gòu)建新的跨膜體系，為研制有效誘導(dǎo)黏膜免疫產(chǎn)生的新型疫苗奠定基礎(chǔ)。

圖4 根據(jù)豬傳染性胃腸炎病毒不同毒株Sa基因核苷酸序列繪制的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖5 利用DNAstar軟件對TGEV Sa片斷的抗原表位分析

[1] 陳秀強(qiáng),劉建華.豬傳染性胃腸炎[J].福建畜牧獸醫(yī),2000, (22) 16: 36-37.

[2] DeLmas B, GeLfi J, Laude H. Antigenic structure of transmissibLe gastroenteritis virus. II. Domains in thepepLomergLycoprotein [J]. JGen Viro,L 1986, 67: 1405-1408.

[3] Sanchez C M,Izeta A,Sanchez-Morgad J M,etaL.Targeted recombination demonstrates that the spike gene of transmissibLe gastroenteritis coronavirus is a determinant of its enterictropism and viruLence[J].J ViroL,1999,73:7607-7618.

[4] Soo J K,Jeong H H,Hyuk M K.PartiaL sequence of the spike gLycoprotein gene of transmissibLe gastroenteritis viruses isoLated in Korea[J]. Veterinary MicrobioLogy, 2003, 94: 195-206.

[5] 吳鋒,黃毓茂.豬傳染性胃腸炎疫苗的研究進(jìn)展[J].畜牧與獸醫(yī),2009,41(12):97-99.

[6] Mesteck J, Lamm ME, etaL Handbook of mucosaL immunoLogy[M].MucosaL immunogLobuLin, 1994: 79-98.

[7] 彭樹英,呂寧,何曉寧,等.豬傳染性胃腸炎病毒纖突蛋白全基因的克隆與序列分析[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報,2007,7(5):1-5.

[8] Brandtzaeg P. Distribution and characteristics of mucosaL immunogLobuiLin-producing ceLLs. In: Handbook of immunoLogy [M]. Boston:Academic Press, 1994: 251-279.

（2011–02–26）

S852.65+9.4

A

1007-1733(2011)04-0001-03