楊雅淇，鄭新濤，趙余慶，3*

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110032；2.沈陽藥科大學(xué)，遼寧 沈陽 110016；3.基于靶點(diǎn)的藥物設(shè)計(jì)與研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110016）

工藝

20（R）-原人參二醇酸水解條件的工藝研究△

楊雅淇1，鄭新濤2，趙余慶2，3*

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110032；2.沈陽藥科大學(xué)，遼寧 沈陽 110016；3.基于靶點(diǎn)的藥物設(shè)計(jì)與研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110016）

目的：優(yōu)化三七莖葉總皂苷的鹽酸水解工藝，提高水解產(chǎn)物20（R）-原人參二醇 [20（R）-protopanaxadiol，20（R）-PPD]的產(chǎn)率。方法：采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察料液比、鹽酸濃度、水解時(shí)間、水解溫度對(duì)三七莖葉總皂苷水解過程的影響。結(jié)果：影響水解的主次因素依次是鹽酸濃度＞料液比＞水解溫度＞水解時(shí)間，優(yōu)選的最佳工藝為料液比1∶1；鹽酸濃度17.1 mol·L－1，水解時(shí)間90 min，水解溫度50℃。結(jié)論：采用優(yōu)化后的水解條件能夠提高PPD的轉(zhuǎn)化率，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

三七莖葉總皂苷；鹽酸水解；PPD

三七為五加科植物三七Panaxnotoginseng（Burk.）F.H.Chen的干燥根，具有散瘀止血，消腫定痛的功能。三七中含有多種類型的成分，人參皂苷為三七的主要有效成分之一。現(xiàn)代藥理研究表明，三七皂苷可通過直接殺傷腫瘤細(xì)胞、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化使其逆轉(zhuǎn)、增強(qiáng)和刺激機(jī)體免疫功能等多種方式起到抗腫瘤作用[1]。正因?yàn)槿呔哂腥绱孙@著的生理活性，近年來成為人們研究的熱點(diǎn)。

研究表明，三七中含有與人參相同或相似的成分。本課題組已有報(bào)道從三七莖葉水解產(chǎn)物中分離得到人參二醇（PD），人參三醇（PT），（20R，25S）β，25-epoxy-20，25-cyclodammaran-3β，6α-diol，達(dá)瑪烷-20（22）-烯-3β，12β，25-三醇和 20（R）-達(dá)瑪烷-3β，12β，20，25-四醇[2-4]。另有文獻(xiàn)報(bào)道，以三七莖葉總皂苷為原料經(jīng)堿水解和酸水解過程分別得到20（S）-原人參二醇和20（R）-原人參二醇（PPD）[5]等20多種活性成分，其中PPD具有較強(qiáng)的抑制癌細(xì)胞增長(zhǎng)的作用，其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性優(yōu)于已經(jīng)成功開發(fā)為一類新藥的人參皂苷Rg3[6]，PPD化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 20（R）-原人參二醇

同時(shí)本課題組已報(bào)道從三七莖葉水解產(chǎn)物中分得的20（R）-25-OH-PPD和25-OCH3-PPD具有顯著的抗癌活性[7]，它們都與 PPD的結(jié)構(gòu)很相似，所以，如果能夠大量制備PPD，以此為先導(dǎo)化合物進(jìn)一步結(jié)構(gòu)修飾，制備和尋求活性更強(qiáng)的抗腫瘤化合物，對(duì)發(fā)現(xiàn)新的活性成分或半合成原料，擴(kuò)大藥用資源及進(jìn)行創(chuàng)新藥物的開發(fā)研究將具有十分重要的意義。

1 材料

1.1 材料

三七莖葉總皂苷（廣西昌洲天然藥物有限公司）；PPD對(duì)照品（含量98%）；鹽酸（分析純）；純凈水。

1.2 儀器

KNAUER高效液相分析色譜儀（德國(guó) KNAUER），Unimicro Technologies蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（上海通微科技有限公司），Kromasil ODS色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm，北京創(chuàng)新科技有限公司），HX502電子天平（慈溪市天東衡器廠），KQ3200DB超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），DK-98-1電熱恒溫水浴鍋（天津力泰斯儀器有限公司），RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀廠），JC202型電熱恒溫干燥箱（上海成順儀器儀表有限公司）。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（0～25 min，87∶13；25～60min，95∶5）。流速：1.0 mL·min－1，柱溫：25℃，檢測(cè)器漂移管溫度：40℃，壓力：2.5×105Pa。進(jìn)樣量：10μL。

2.2 對(duì)照品和供試溶液的配制

稱取干燥至恒重的皂苷元PPD適量，加甲醇制成濃度為 15 mg·mL－1對(duì)照品溶液。對(duì)照品溶液HPLC圖見圖2。

圖2 PPD對(duì)照品HPLC圖

取水解產(chǎn)物樣品適量，精密稱定，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜（0.45μm）濾過，得濃度為 10 mg·mL－1的供試品溶液。

2.3 三七莖葉總皂苷鹽酸水解單因素試驗(yàn)

2.3.1 不同濃度鹽酸對(duì)三七莖葉總皂苷水解的影響分別稱取1 g三七莖葉總皂苷，共5份，分別加入濃度為 2.87，6，7.7，9.45，17.1 mol·L－1的鹽酸1 mL，55℃水解1.5 h，水解產(chǎn)物經(jīng)液相檢測(cè)，計(jì)算三七莖葉總皂苷水解產(chǎn)物中PPD含量。

2.3.2 不同溫度對(duì)三七莖葉總皂苷水解的影響 分別稱取1 g三七莖葉總皂苷，共5份，加入1 mL 17.1 mol·L－1的鹽酸，分別在 45，50，55，60，65℃水解1.5 h，水解產(chǎn)物經(jīng)液相檢測(cè)，計(jì)算三七莖葉總皂苷水解產(chǎn)物中PPD含量。

2.3.3 不同水解時(shí)間對(duì)三七莖葉總皂苷水解的影響分別稱取1 g三七莖葉總皂苷，共5份，加入1 mL 17.1 mol·L－1的鹽酸，在 55℃分別水解 30，40，50，60，90 min，水解產(chǎn)物經(jīng)液相檢測(cè)，計(jì)算三七莖葉總皂苷水解產(chǎn)物中PPD含量。

2.3.4 不同料液比對(duì)三七莖葉總皂苷水解的影響分別稱取1 g三七莖葉總皂苷，共5份，分別加入濃度為 17.1 mol·L－1的鹽酸0.8，1，1.5，2，2.5 mL，在55℃水解1.5 h，水解產(chǎn)物經(jīng)液相檢測(cè)，計(jì)算三七莖葉總皂苷水解產(chǎn)物中總PPD含量。

2.4 三七莖葉總皂苷鹽酸水解正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素得出的最佳提取條件，設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn)，并進(jìn)行極差分析和方差分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 三七莖葉總皂苷鹽酸水解單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 鹽酸濃度對(duì)三七莖葉總皂苷水解產(chǎn)物中PPD含量的影響 圖3反映了不同鹽酸濃度對(duì)三七莖葉總皂苷水解產(chǎn)物中PPD含量的影響，可以看出，不同的鹽酸濃度對(duì)三七莖葉總皂苷水解的影響很明顯，當(dāng)鹽酸濃度為17.1 mol·L－1時(shí)PPD達(dá)到最高值，說明PPD在一定的酸度下才能得到較徹底的水解。

圖3 不同鹽酸濃度對(duì)三七莖葉總皂苷水解產(chǎn)物中PPD含量的影響

3.1.2 溫度對(duì)三七莖葉總皂苷水解的影響 圖4反映了不同溫度對(duì)三七莖葉總皂苷水解的影響，可以看出，當(dāng)溫度由50℃時(shí)，PPD情況達(dá)到最好，之后隨著溫度的升高量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

圖4 不同水解溫度對(duì)三七莖葉總皂苷水解產(chǎn)物中PPD含量的影響

3.1.3 水解時(shí)間對(duì)三七莖葉總皂苷水解的影響 圖5反映了不同水解時(shí)間對(duì)三七莖葉總皂苷水解的影響，可以看出，90 min時(shí)水解情況達(dá)到最好，之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，PPD含量變化幅度趨于平緩。其原因可能是水解基本完全。

3.1.4 料液比對(duì)三七莖葉總皂苷水解的影響 圖6反映了不同料液比對(duì)三七莖葉總皂苷水解的影響，當(dāng)料液比為1倍時(shí)，PPD情況達(dá)到最好，之后隨著料液比的升高量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

圖5 不同水解時(shí)間對(duì)三七莖葉總皂苷水解產(chǎn)物中PPD含量的影響

圖6 不同料液比對(duì)三七莖葉總皂苷水解產(chǎn)物中PPD含量的影響

3.2 三七總皂苷的鹽酸水解的因素水平表

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)考察結(jié)果，設(shè)計(jì)以酸濃度（濃鹽酸）、水解溫度、超聲時(shí)間、料液比4個(gè)因素3水平的L9（34）正交試驗(yàn)，結(jié)果見表1、2。

表1 三七總皂苷酸水解L9（34）正交試驗(yàn)

表2 方差結(jié)果分析

從結(jié)果可以看出，影響PPD含量高低的因素依次為鹽酸濃度＞料液比＞水解溫度＞水解時(shí)間。在反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和料液比一致的情況下，A3水平PPD得率最高；在鹽酸濃度、反應(yīng)時(shí)間和料液比一致的情況下，B1水平效果最好；鹽酸濃度、反應(yīng)溫度和料液比一樣的前提下C3水平的效果最佳；在鹽酸濃度、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間相同的前提下D2水平效果最好。因此，最終選定A3B1C3D2為三七總皂苷酸水解的最佳工藝，HPLC色譜圖見圖7。

圖7 PPD最佳工藝HPLC圖

4 討論

三七總皂苷是一類活性很好的化合物，具有廣泛的生理活性。這些化合物都是通過運(yùn)用傳統(tǒng)經(jīng)典的植化手段和現(xiàn)代色譜技術(shù)獲得，其單體皂苷的制備過程通常經(jīng)過提取、萃取、柱層析等步驟，整個(gè)過程顯得比較漫長(zhǎng)、繁瑣。目前，有關(guān)三七總皂苷及其單體皂苷的研究多集中于提取純化工藝和含量測(cè)定方面，水解作為一種獲得三七皂苷單體的手段對(duì)其研究還比較少。

三七皂苷的抗腫瘤活性已經(jīng)得到證實(shí)，而PPD的結(jié)構(gòu)與這些活性單體皂苷相似。因此，可以將其作為研究三七皂苷構(gòu)效關(guān)系的先導(dǎo)化合物，進(jìn)行一定程度上的結(jié)構(gòu)修飾，開發(fā)成為抗癌活性更強(qiáng)的新藥，具有潛在的開發(fā)和研究?jī)r(jià)值。

本文在充分積累本課題組前期大量有關(guān)三七皂苷及其水解研究的基礎(chǔ)上，首次對(duì)三七總皂苷酸水解產(chǎn)物PPD的水解工藝進(jìn)行了研究，運(yùn)用單因素考察和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)得出了PPD的最佳水解工藝：料液比1∶1；鹽酸濃度17.1 mol·L－1，水解時(shí)間 90 min，水解溫度50℃。此條件下PPD的產(chǎn)率最高可達(dá)9.7%，非常適合工業(yè)化生產(chǎn)。

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Study on the Technology of Hydrolysis Process of 20（R）-PPD w ith Hydrochloric Acid

YANG Ya-qi1，ZHENG Xin-tao2，ZHAO Yu-qing2，3
（1.LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Shenyang110032，China；2.ShenyangPharmaceutical University，Shenyang110016，China；3.KeyLaboratoryofStructure-BasedDrugDesign＆DiscoveryofMinistry ofEducation，ShenyangPharmaceuticalUniversity，Shenyang110016，China）

Objective：To optimize the hydrolysis technology of total saponins inPanaxnotoginsengwith hydrochloric acid in order to increase the yield of 20（R）-PPD.Methods：Orthogonal design was used to optimize the hydrolysis condition and four factors including solid/liquid ratio，concentration，reaction time and reaction temperature were investigated to study the process of hydrolysis.Results：The primary and secondary influence factors of this processwere listed as follows：concentration＞solid/liquid ratio＞temperature＞time and the optimization technology of hydrolysis process obtained was：the ratio of liquid to solid material at1∶1，the concentration of hydrochloric acid with 17.1 mol·L－1，and the reaction time and temperaturewere 1.5 h and 50℃ respectively.Conclusion：The yield of20（R）-PPD under the optimum hydrolysis condition was raised and this technology can be used for industrialization production.

Total panax notoginseng saponins；Hydrolysis；PPD

遼寧省天然產(chǎn)物現(xiàn)代分離與工業(yè)化制備工程技術(shù)中心（2008402021）

*趙余慶，Tel：（027）23986521 E-mail：zyq4885＠126.com

2011-04-06）