章飛燕，葉鵬程，任其龍

（浙江大學(xué)天然藥物與精細(xì)分離研究室，浙江杭州310027）

陰離子交換色譜法一步分離牛初乳中的SIGA

章飛燕，葉鵬程，任其龍*

（浙江大學(xué)天然藥物與精細(xì)分離研究室，浙江杭州310027）

利用強(qiáng)堿3#樹脂陰離子交換色譜法從牛初乳中分離獲得分泌型免疫球蛋白A?？疾炝司彌_液pH和離子強(qiáng)度對(duì)所獲免疫球蛋白A產(chǎn)品純度的影響，獲得從牛初乳中分離免疫球蛋白A的最優(yōu)條件為pH 7.0，離子強(qiáng)度為0.03mol/L的磷酸鹽緩沖液，最終可獲得純度為91.24%的免疫球蛋白A，回收率達(dá)到47%。因此，利用以強(qiáng)堿3#樹脂為基質(zhì)的陰離子交換色譜分離牛初乳中的免疫球蛋白A具有很好的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

分泌型免疫球蛋白A（sIgA），牛初乳，陰離子交換色譜，分離

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

平衡緩沖液 離子強(qiáng)度為0.03mol/L，pH分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.3、7.5、8.0的磷酸鈉緩沖液、離子強(qiáng)度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mol/L，pH為7.0的磷酸鈉緩沖液；洗脫緩沖液 在平衡緩沖液中加入0.5mol/L的NaCl；透析袋 截留分子量MW為3500Da；強(qiáng)堿3#樹脂 上海華震科技貿(mào)易公司，淡黃色透明球狀顆粒，聚苯乙烯-二乙烯苯共聚基體，離子交換基為季氨基［-N（CH3）3OH］，粒度范圍0.3～1.2mm；牛初乳原料樣品 牛初乳離心脫脂后的乳清經(jīng)過(guò)40%的硫酸銨沉淀，獲得鹽析產(chǎn)品，sIgA的含量約為16%～19%。

XK 16玻璃空柱管 i.d.1.6cm，Phamacia Biotech公司；Waters高效液相色譜儀 配可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司；DELTA 320 pH計(jì) DELTA公司；Mini-PROTEAN電泳系統(tǒng) 美國(guó) Bio-rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牛初乳樣品中蛋白組成的分析

1.2.1.1 流動(dòng)相的配制 A液（pH7.0，0.05mol/L磷酸鹽緩沖液）：8.955g磷酸氫二鈉+7.802g磷酸二氫鈉，加純凈水定容至1000mL；B液（pH2.5，0.05mol/L甘氨酸鹽酸緩沖液）：3.752g甘氨酸+純凈水250mL +150mL 0.2mol/L鹽酸，雙蒸水溶解并定容至1000mL。

1.2.1.2 色譜條件 色譜柱：Hi-Trap Protein G柱，1mL；色譜柱的平衡：用純凈水洗柱（流速1mL/min）約30min至基線平衡，再用A液平衡色譜柱至基線穩(wěn)定；檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm；進(jìn)樣量：60!L。

1.2.1.3 梯度洗脫 按表1參數(shù)進(jìn)行梯度洗脫。

表1 HPLC梯度洗脫表

1.2.2 牛初乳免疫球蛋白在強(qiáng)堿3#樹脂層析柱中的分離 濕法裝柱，穩(wěn)定后柱高16.3cm。用平衡緩沖液平衡強(qiáng)堿3#樹脂層析柱，設(shè)定流速為0.5mL/min。待基線穩(wěn)定后，進(jìn)樣1mL（牛初乳原料樣品濃度50mg/mL），用平衡緩沖液將不被吸附的IgG全部直接洗脫出來(lái)，收集第一組峰，稱為組分A。再用含有0.5mol/L NaCl的洗脫緩沖液洗脫至檢測(cè)不到Ig，收集第二組峰B，稱為組分B。用0.8mol/L的NaCl溶液洗滌強(qiáng)堿3#樹脂層析柱大約2BV再生。

1.2.3 組分B的濃縮 收集的組分B用PEG-6000在4℃下透析濃縮10倍。

1.2.4 非還原性SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 濃縮膠5%，分離膠8%。

2 結(jié)果與討論

2.1 牛初乳樣品在HPLC上的分析結(jié)果

由于在中性條件下，IgG與蛋白G之間有很強(qiáng)的親和性，只有在強(qiáng)酸條件下（pH2～3）才能被洗脫下來(lái)，因此峰2（7.0～8.0min）對(duì)應(yīng)的即為IgG，而中性條件下不吸附的為富含 sIgA的組分，與圖中峰 1（0.4～2.0min）所對(duì)應(yīng)。因?yàn)槿鄙贅?biāo)樣，本文所有含量分析均由HPLC譜圖中的峰面積之比得到。

2.2 pH的影響

因?yàn)槊庖咔虻鞍椎牡入婞c(diǎn)不是一個(gè)特定的值，而是一個(gè)范圍，所以在不同pH的緩沖液條件下，蛋白表面的帶電量也不同，導(dǎo)致它在強(qiáng)堿樹脂上的吸附行為的差異。因此考察在離子強(qiáng)度為0.03mol/L的條件下，不同pH（6.0、6.5、7.0、7.3、7.5和8.0）的緩沖液對(duì)組分B中sIgA的純度和收率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖1 牛初乳溶液的HPLC分析圖

圖2 磷酸鹽緩沖液pH對(duì)組分B中sIgA純度和收率的影響

由圖2可知，當(dāng)緩沖液pH＜7.0時(shí)，組分B中sIgA的純度隨著pH的升高而升高，這是因?yàn)楫?dāng)溶液pH升高時(shí)，sIgA分子所帶負(fù)電荷的量增多，使得sIgA在強(qiáng)堿樹脂上的吸附增多；當(dāng)緩沖液pH＞7.0時(shí)，IgG分子所帶的正電荷減少，部分甚至帶上了負(fù)電荷而被吸附在強(qiáng)堿樹脂上，所以組分B中sIgA的純度隨著pH的升高而降低。因?yàn)閟IgA的吸附量隨著溶液pH的增大而增大，所以組分B中sIgA的收率隨著pH的增大而增大。

因此，在溶液離子強(qiáng)度為0.03mol/L的條件下，pH為7.0是牛初乳免疫球蛋白在強(qiáng)堿3#樹脂上分離的最佳pH。

2.3 離子強(qiáng)度的影響

與緩沖液pH類似，緩沖液的離子強(qiáng)度能夠改變免疫球蛋白在強(qiáng)堿樹脂上的吸附行為，從而導(dǎo)致組分B中sIgA純度和收率的變化。在溶液pH為7.0的條件下，考察溶液離子強(qiáng)度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mol/L條件下，牛初乳免疫球蛋白在強(qiáng)堿3#樹脂中的分離，從而獲得分離IgG和sIgA的最佳溶液離子強(qiáng)度，結(jié)果如圖3所示。

圖3 磷酸鹽緩沖液離子強(qiáng)度對(duì)組分B中sIgA純度和收率的影響

由圖3可知，在低離子強(qiáng)度的緩沖溶液中，IgG不能有效地被頂替下來(lái)，而被保留在層析柱中，并在洗脫過(guò)程中，被更高離子強(qiáng)度的洗脫液與sIgA一起洗脫下來(lái)。而隨著緩沖液離子強(qiáng)度的增大，頂替作用增強(qiáng)，使得組分B中IgG的含量減少，因此sIgA的純度提高。但隨著溶液離子強(qiáng)度的進(jìn)一步提高，sIgA在頂替過(guò)程中的損失也變大，使得組分B中sIgA的純度反而降低。又因?yàn)槿芤弘x子強(qiáng)度越高，洗脫能力越強(qiáng)，使得相同條件下，吸附到樹脂上的蛋白分子減少，因此組分B中sIgA的收率隨著緩沖液離子強(qiáng)度的增大而降低。

綜上所述，緩沖液pH為7.0的條件下，在強(qiáng)堿3#樹脂上分離 IgG和 sIgA的最佳離子強(qiáng)度為0.03mol/L。

2.4 牛初乳免疫球蛋白在磷酸鹽緩沖液中的層析分離

根據(jù)2.2和2.3實(shí)驗(yàn)所獲得的最佳緩沖液條件（pH7.0，0.03mol/L磷酸鹽緩沖液），將牛初乳原料樣品在強(qiáng)堿3#樹脂上進(jìn)行層析分離，獲得如圖4所示的洗脫曲線。

圖4 牛初乳原料樣品在強(qiáng)堿3#樹脂上層析分離的洗脫曲線

2.4.1 HPLC分析 如1.2所述收集組分A和組分B，分別在HPLC系統(tǒng)上檢測(cè)分析。根據(jù)液相圖譜峰面積之比，計(jì)算獲得組分A和組分B中IgG和sIgA的含量組成，結(jié)果如表2所示。

表2 牛初乳上樣溶液、組分A和組分B的蛋白組成分析結(jié)果

2.4.2 非還原性SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析非還原性SDS-PAGE是在蛋白樣品處理時(shí)，樣品緩沖液中不加入還原劑巰基乙醇，因此免疫球蛋白分子不會(huì)因二硫鍵被打斷而變成重鏈和輕鏈的片段。

將牛初乳上樣溶液、組分A和濃縮10倍后的組分B用非還原性SDS-PAGE檢測(cè)，鑒定其中所含的免疫球蛋白種類，結(jié)果如圖5所示。

從圖5的電泳結(jié)果中可以看到，組分A中含有大部分的IgG（Mr=160kDa）和少量的sIgA（Mr= 390kDa），而組分B只觀察到sIgA的條帶，IgG可能因?yàn)楹刻投鵁o(wú)法檢測(cè)到，這也說(shuō)明了組分B中含有純度較高的sIgA，與液相檢測(cè)所得到的結(jié)果是一致的。

圖5 非還原性SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

經(jīng)離心脫脂后得到的牛初乳乳清通過(guò)40%的硫酸銨沉淀，獲得的鹽析產(chǎn)品中含有約16%～19%的sIgA。通過(guò)以強(qiáng)堿3#樹脂為基質(zhì)的陰離子交換色譜可以將sIgA從此鹽析產(chǎn)品中分離出來(lái)。在磷酸鹽緩沖液體系中，sIgA產(chǎn)品的純度隨著溶液pH和離子強(qiáng)度的增大，均先升高后降低，收率隨著溶液pH的升高而略有增加，離子強(qiáng)度對(duì)收率的影響并不明顯。pH7.0，離子強(qiáng)度為0.03mol/L的磷酸鹽溶液為分離的最優(yōu)條件。在32.8mL的強(qiáng)堿3#樹脂層析柱中，當(dāng)上樣量為 1.52g/mL強(qiáng)堿 3#樹脂，上樣濃度為50mg/mL時(shí)，在最優(yōu)條件下可獲得純度為91.24%的sIgA產(chǎn)品，收率達(dá)到47.00%。

［1］陸東林，曹勁松，王蕓張，等.中國(guó)乳制品工業(yè)行業(yè)規(guī)范——生鮮牛初乳RHB 601-2005［S］.新疆畜牧業(yè)，2006（2）：25-26.

［2］傅維琦，吳綿斌，李向平，等.牛初乳中主要活性物質(zhì)開(kāi)發(fā)的最新進(jìn)展［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2003，29（4）：76-80.

［3］Mahi Josrpine.Colostrum：Life's First Food［J］.Total Health，1999，21（2）：22-24.

［4］Hilpert H，Brüssow H，Mietens C，et al.Use of bovine milk concentrate containing antibody to rotavirus to treat rotavirus gastroenteritis in infants［J］.The Journal of Infectious Diseases，1987，156（1）：158-166.

［5］Playne MJ，Bennett LE，Smithers GW.Functional dairy foods and ingredients［J］.Australian Journal of Dairy Technology，2003，58（3）：242-264.

Single-step purification of sIgA from bovine colostrums by anion-exchange chromatography

ZHANG Fei-yan，YE Peng-cheng，REN Qi-long*
（National Laboratory of Secondary Resources Chemical Engineering，Zhejiang University，Hangzhou 310027，China）

A fraction containing sIgA（sIgA-rich fraction）was prepared from bovine colostrum by anion exchange chromatography using alkali resin.The effect of changing buffer properties（pH and ionic strength）on purity of sIgA was studied.The best result was sIgA purity increasing from 16.31%in bovine colostrum solution to 91.24%in the eluting fraction with a recovery of 47%at the condition of pH 7.0，0.03mol/L sodium phosphate.These results suggested that the anion exchange chromatography using alkali resin was a potential process for sIgA purification from bovine colostrum.

secretory immunoglobulin A（sIgA）；bovine colostrum；anion-exchange chromatography；separation

TS252.1

B

1002-0306（2011）02-0261-03

牛初乳（Bovine Colostrum）是指從正常飼養(yǎng)的、無(wú)傳染病和乳房炎的健康母牛分娩后72h內(nèi)所擠出的乳汁［1］。它是一種淡黃色、味微苦的粘稠狀液體，含有大量的免疫因子和生長(zhǎng)因子，是自然界中最重要的生物資源之一。牛初乳中所含的生物活性物質(zhì)主要包括免疫球蛋白、乳鐵蛋白、胰島素樣生長(zhǎng)因子以及各種酶類等，含量比常乳高10～100倍，這些生理活性成分具有免疫調(diào)節(jié)、延緩衰老、促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育、抑制腫瘤等一系列的生物功能［2］。早在幾千年前的古印度就有食用牛初乳的記載［3］。1977年Hilpert提出了將牛初乳乳清中的免疫球蛋白富集后應(yīng)用于嬰兒奶粉中的設(shè)想；1987年Mietens等人證實(shí)口服含有免疫球蛋白的牛奶，就能有效預(yù)防輪狀病毒、痢疾桿菌等病菌的侵害［4］；1995年Lehto E.等人提出動(dòng)物初乳可作為一種功能性的食品基料［5］。我國(guó)目前也有多家企業(yè)在進(jìn)行牛初乳相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)，但大部分都停滯在對(duì)牛初乳IgG的制備，牛初乳sIgA的開(kāi)發(fā)還比較落后。而牛初乳IgG只能部分取代母乳中sIgA的功能，因此，為了高效地綜合利用牛初乳資源中的免疫球蛋白，有必要開(kāi)發(fā)出合理的分離技術(shù)路線，獲得高純度的sIgA產(chǎn)品。本文主要側(cè)重于經(jīng)脫脂、鹽析處理后得到的牛初乳樣品中sIgA的分離純化工藝的研究，開(kāi)發(fā)一種能簡(jiǎn)單快速生產(chǎn)高純度牛初乳sIgA的工藝路線。

2010-03-02 *通訊聯(lián)系人

章飛燕（1984-），女，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物分離。