高 雪，王 倩，李 珂，吳蕊蕊，王寶山，*，李國強(qiáng)

(1.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東濟(jì)南250014; 2.中國海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，山東青島266000)

高效液相色譜法優(yōu)化鹽地堿蓬甜菜紅素提取工藝研究

高 雪1，王 倩1，李 珂1，吳蕊蕊1，王寶山1，*，李國強(qiáng)2，*

(1.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東濟(jì)南250014; 2.中國海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，山東青島266000)

以黃河三角洲潮間帶鹽地堿蓬地上部分為實(shí)驗(yàn)材料，采用高效液相色譜法，通過測(cè)定實(shí)現(xiàn)基線分離的甜菜紅素類成分在特征吸收波長550nm下的峰面積，對(duì)甜菜紅素的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，在室溫下，以60%乙醇為提取溶劑，料液比1∶20，超聲浸提30min，浸提2次，可最大效率地提取鹽地堿蓬中的甜菜紅素類成分。

高效液相色譜，鹽地堿蓬，甜菜紅素，提取工藝

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫紅色表型鹽地堿蓬 以生長在黃河三角洲潮間帶的紫紅色表型鹽地堿蓬(Suaeda salsa L.)的地上部分洗凈烘干，粉碎機(jī)粉碎，-20℃保存?zhèn)溆?乙醇分析純，煙臺(tái)三和化學(xué)試劑有限公司;甲醇 分析純，色譜純，天津廣成化學(xué)試劑有限公司;水 娃哈哈純凈水，杭州娃哈哈有限公司;ODS填料 50μm，北京綠百草科技發(fā)展有限公司。

表2 鹽地堿蓬中甜菜紅素的HPLC數(shù)據(jù)

Agilent 1100高效液相色譜儀 G1379A脫氣機(jī)，G1311A四元泵，G1313A自動(dòng)進(jìn)樣儀，G1316A柱溫箱，G1315A DAD二極管陣列檢測(cè)器，HPLC化學(xué)工作站;色譜柱 Agilent Zorbax XDB C18柱(4.6mm× 250mm，5μm);Agilent 1100 LC/MSD TOF液質(zhì)聯(lián)用儀 美國;DS-1高速組織搗碎機(jī) 上海標(biāo)本模型制造廠;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 Heidolph，德國;KQ-250B型超聲儀 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 流動(dòng)相:A為0.1%甲酸水，B為甲醇，梯度洗脫:B相(體積%)，0～30min(20～30);流速:1.0mL·min-1;檢測(cè)波長:550nm;進(jìn)樣量:20μL;柱溫:25℃。

1.2.2 提取溶劑選擇 稱取1g鹽地堿蓬粉末5份，分別加入水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇和80%乙醇各50mL，超聲提取30min。抽濾，濾液低溫(40℃)濃縮至一定體積，用ODS小柱純化。以pH3.0的甲酸水溶液洗脫除鹽，95%甲醇-甲酸水洗脫，洗脫液低溫(40℃)蒸干，殘?jiān)?.5mL水溶解，0.45μm微孔濾膜過濾，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計(jì)算峰面積。

1.2.3 提取方式的選擇 稱取1g鹽地堿蓬粉末3份，分別加入60%乙醇，以室溫冷浸、超聲及熱回流三種浸提方式提取30min。抽濾，濾液低溫(40℃)濃縮至一定體積，用ODS小柱純化。以pH3.0的甲酸水溶液洗脫除鹽，95%甲醇-甲酸水洗脫，洗脫液低溫(40℃)蒸干，殘?jiān)?.5mL水溶解，0.45μm微孔濾膜濾過，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計(jì)算峰面積。

1.2.4 正交設(shè)計(jì) 以提取次數(shù)A、提取時(shí)間B和料液比C三個(gè)因素作為考察鹽地堿蓬甜菜紅素提取工藝的主要影響因素，采用L9(33)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平

2 結(jié)果與討論

2.1 提取物組成分析

為了對(duì)甜菜紅素類成分組成進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)首先通過色譜條件優(yōu)化，建立了能夠使甜菜紅素類成分個(gè)峰達(dá)到基線分離的色譜條件，如1.2.1所述。在該色譜條件下，鹽地堿蓬提取物的化學(xué)成分得到了較好分離(圖1)。其中，峰1～4的最大吸收在546nm左右，質(zhì)譜碎片中均含有甜菜紅素類成分母核碎片離子(質(zhì)荷比388)，證明峰1～4均屬于甜菜紅素類成分［8］。峰1～4占總峰面積的84.89%，表明甜菜紅素類成分為提取物中的主成分(見表2)。

圖1 鹽地堿蓬甜菜紅素的液相色譜圖

2.2 提取溶劑選擇

以峰1～4總峰面積為評(píng)價(jià)依據(jù)，由圖2可知，提取溶劑為水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇的甜菜紅素峰面積均沒有明顯差異，而80%乙醇浸提的甜菜紅素峰面積顯著降低，一定量的乙醇能降低某些酶的活性。從純化、提取效率等綜合考慮，選取60%乙醇作為實(shí)驗(yàn)的提取溶劑。

圖2 浸提劑對(duì)甜菜紅素提取效率的影響注:數(shù)據(jù)為3個(gè)重復(fù)的平均值±SE，*表示差異顯著(p＜0.05)，圖3同。

2.3 提取方式選擇

選用60%乙醇作為提取試劑，分別用冷浸、超聲和熱回流三種方式提取，以峰1～4總峰面積為計(jì)算依據(jù)，結(jié)果如圖3。三種提取方式均沒有顯著差異，熱回流提取方式溫度較高，樣品易降解，對(duì)甜菜紅素的穩(wěn)定性有一定影響。超聲提取操作簡單，提取效果更為理想，因此實(shí)驗(yàn)確定選用超聲的方式進(jìn)行提取。

2.4 提取工藝優(yōu)化

采用60%乙醇超聲提取，對(duì)影響甜菜紅素提取的主要工藝參數(shù)提取次數(shù)、提取時(shí)間、料液比進(jìn)行了三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。因素水平設(shè)計(jì)見表1，結(jié)果見表3。

由表3中極差R值大小可知，各因素作用主次A＞C＞B，即浸提次數(shù)＞料液比＞浸提時(shí)間。分析各因素不同水平的甜菜紅素提取率(以峰1～4總峰面積計(jì))，A2與A3、B因素三個(gè)水平及C2與C3的均值差異不大。考慮到工業(yè)應(yīng)用成本因素，甜菜紅素的最佳提取工藝選擇為A2B1C2，即室溫下，用60%乙醇以1∶20料液比超聲浸提30min，浸提2次。正交實(shí)驗(yàn)4號(hào)的峰1～4總峰面積為21001，在9次實(shí)驗(yàn)中峰面積最大，與優(yōu)化工藝參數(shù)一致，也進(jìn)一步證實(shí)了所建立的優(yōu)化甜菜紅素提取工藝的可靠性。

圖3 提取方式對(duì)甜菜紅素提取效率的影響

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

紫紅色表型鹽地堿蓬是廣泛分布于濱海濕地或部分澇洼積水地帶的一年生草本耐鹽植物，生物量大，其中的無毒天然紅色素是合理開發(fā)利用鹽生植物資源的可行途徑之一。甜菜紅素類成分極性較大，酸、堿、光、熱穩(wěn)定性差，分離與結(jié)構(gòu)鑒定難度較大。本研究參照文獻(xiàn)［9-10］，選擇ODS固相萃取小柱pH3.0的酸水洗脫鹽，通過色譜條件優(yōu)化，首次建立了所有色譜峰均達(dá)到基線分離的HPLC色譜分析條件。并運(yùn)用LC-MS連用技術(shù)，通過各色譜峰質(zhì)譜裂解碎片所提供的結(jié)構(gòu)信息，結(jié)合各色譜峰的紫外及可見光的最大吸收特征光譜，指認(rèn)了鹽地堿蓬提取物中的甜菜紅素類成分。所建立的HPLC分析方法對(duì)于準(zhǔn)確評(píng)價(jià)甜菜紅素提取工藝具有重要價(jià)值。

到目前為止，未見定量研究鹽地堿蓬中甜菜紅素提取工藝的報(bào)道。實(shí)驗(yàn)以甜菜紅素類成分的總峰面積為相對(duì)定量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，通過正交設(shè)計(jì)，建立了高效提取鹽地堿蓬中甜菜紅素的制備工藝:室溫，60%乙醇，1∶20料液比，超聲浸提30min，浸提2次。在優(yōu)化的提取條件下，提取物中甜菜紅素相對(duì)含量達(dá)到85.24%。研究結(jié)果具有較好的應(yīng)用開發(fā)前景。

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Optimization of extraction technology of betacyanins from Suaeda salsa L.by high performance liquid chromatography

GAO Xue1，WANG Qian1，LI Ke1，WU Rui-rui1，WANG Bao-shan1，*，LI Guo-qiang2，*
(1.College of Life Sciences，Shandong Normal University，Jinan 250014，China; 2.School of Medicine and Pharmacy，Ocean University of China，Qingdao 266000，China)

The aerial part of Suaeda salsa L.growing in the intertidal area of Yellow River Delta were used to optimize the extraction technology of betacyanins.The optimum extraction conditions of that 60%ethanol solution was used as extraction solvent，ratio of material to solvent was 1∶20 and extraction was achieved with ultrasonic twice at room temperature in 30min，were established by determining the total peak areas of four betacyanin components in high performance liquid chromatography.

high performance liquid chromatography;Suaeda salsa L.;betacyanin;extraction technology

TS201.1

B

1002-0306(2011)03-0259-04

鹽地堿蓬(Suaeda salsa L.)，別名黃須菜、鹽吸、堿蔥，屬藜科(Chenopodiaceae)堿蓬屬(Suaeda)一年生草本植物，是一種肉質(zhì)化真鹽生植物，能在鹽堿化土壤和濱海灘涂地區(qū)正常完成生活史［1］。自然條件下鹽地堿蓬主要有兩種表型:在濱海的潮間帶或部分澇洼積水地帶生長的植株，在整個(gè)生長期地上部分皆為紫紅色;而在地勢(shì)較高或距離海邊較遠(yuǎn)的鹽堿地植株則呈現(xiàn)綠色。王長泉等已經(jīng)初步確定其紅色素為甜菜素類的甜菜紅素［2］。甜菜素是一種水溶性含氮色素，包括甜菜紅素(betacyanin)和甜菜黃素(betaxanthin)2種類型［3］。到目前為止，人們發(fā)現(xiàn)石竹目13個(gè)科的植物中除粟米草科和石竹科積累花色素外，其他各科植物都積累甜菜素，部分高等真菌中也發(fā)現(xiàn)產(chǎn)甜菜素［4-5］。甜菜紅素作為天然食用色素，不僅安全無毒，而且營養(yǎng)價(jià)值較高，對(duì)人體有諸多醫(yī)療保健作用，是廣泛使用的純天然色素之一。為了合理開發(fā)利用鹽生植物資源，已有學(xué)者對(duì)鹽地堿蓬甜菜素的提取工藝進(jìn)行過研究。吳濤等［6］利用分光光度法，研究了鹽地堿蓬紅色素的提取工藝以及光、熱、pH、氧化還原劑、糖、金屬離子等對(duì)色素穩(wěn)定性的影響。本實(shí)驗(yàn)室前期也采用紫外分光光度法較系統(tǒng)地研究了浸提溶劑、浸提時(shí)間、浸提溫度、料液比、浸提次數(shù)等因素對(duì)鹽地堿蓬紅色素提取的影響［7］。分光光度法是基于化學(xué)成分的最大吸收波長與物質(zhì)的量的線性關(guān)系的一種定量分析方法，雖然操作簡單，但選擇性較低。因而本文利用高效液相色譜法，通過測(cè)定實(shí)現(xiàn)基線分離的甜菜素類成分在特征吸收波長550nm下的總峰面積，運(yùn)用正交設(shè)計(jì)，對(duì)鹽地堿蓬甜菜紅素的提取工藝進(jìn)行了研究。所使用的研究方法選擇性強(qiáng)，結(jié)論準(zhǔn)確，研究結(jié)果對(duì)于耐鹽植物鹽地堿蓬資源甜菜紅素的組成分析及合理開發(fā)利用具有重要的借鑒價(jià)值。

2010-07-28 *通訊聯(lián)系人

高雪(1986-)，女，碩士研究生，研究方向:植物生理與分子生物學(xué)。

國家自然科學(xué)基金(30870138);科技部高新計(jì)劃項(xiàng)目(863)資助(2007AA091701)。