王會(huì)友，王 濤，王振宇，2，于 偉

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院食品科學(xué)專(zhuān)業(yè)，黑龍江哈爾濱150040; 2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150086)

固定化小麥酯酶生物傳感器的制備及應(yīng)用

王會(huì)友1，王 濤1，王振宇1，2，于 偉1

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院食品科學(xué)專(zhuān)業(yè)，黑龍江哈爾濱150040; 2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150086)

將固定化酶膜與精密酸度計(jì)的玻璃電極連接制備出了生物傳感電極探頭，并對(duì)兩種常見(jiàn)的有機(jī)磷農(nóng)藥樂(lè)果和敵百蟲(chóng)進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果:樂(lè)果濃度在1×10-8～1×10-3mol/L內(nèi)與小麥酯酶的抑制率呈線性關(guān)系，回歸方程為y=13.02x +118.7，相關(guān)系數(shù)為0.995，最低檢出限(LDC)為1.7×10-9mol/L;敵百蟲(chóng)濃度在1×10-8～1×10-3mol/L內(nèi)與小麥酯酶的抑制率呈線性關(guān)系，回歸方程為y=13.08x+112.7，相關(guān)系數(shù)為0.997，LDC為1.1×10-8mol/L。以國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)得結(jié)果為對(duì)照，進(jìn)行實(shí)際樣品檢測(cè)，檢測(cè)方程得出的結(jié)果回收率為真實(shí)值的87.9%～92.3%，而生物敏感膜重復(fù)使用20次以內(nèi)其酶活保存率為初始酶活的90%左右。因此，此傳感器可以應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)有機(jī)磷農(nóng)藥的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)等。

固定化，小麥酯酶，生物傳感器，有機(jī)磷農(nóng)藥

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥(龍麥26號(hào)) 黑龍江省農(nóng)科院育種研究所提供;固定化小麥酯酶酶膜 實(shí)驗(yàn)自制;丙酮 天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠;α-萘酚、乙酸-α-萘酯國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;固藍(lán)B、TritonX-100、2-吡啶醛肟甲基碘化物 Sigma;TEOS 北化恒業(yè)精細(xì)化工有限公司;PVA 天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心;PEG-400、甘油 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

電子恒溫水浴鍋(DK-98-I) 天津泰斯特儀器有限公司;磁力攪拌器(78-1) 江蘇海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司;精密型酸度計(jì)(pHS-3C) 上海雷磁儀器廠;飽和甘汞電極 上海羅素科技有限公司;氣相色譜儀(GC-2010) 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 固定化小麥酯酶酶膜的制備工藝 小麥→粉碎→過(guò)40目篩→鹽溶液提取→離心分離→取上清液→過(guò)濾→測(cè)定酶活→固定化制備小麥酯酶酶膜

固定化制備方法:將去離子水與一定量的硅酸酯類(lèi)化合物按照一定比例混合(R值為8.25，V/V)，加入25μL HCl，120mL甘油溶液(75%)和400mL聚乙烯醇(PVA)溶液(5%)，超聲30min。之后吸取80μL溶膠，加入 150μL 9.84%的 TritonX-100和162μL 5.41%的PEG-400溶液，漩渦振蕩20min即得到溶膠。

將小麥酯酶以30mL/g的比例溶解于pH6.6的磷酸緩沖溶液(PBS)中，磁力攪拌30min。吸取60μL的酶液加入到雜化溶膠中，旋渦振蕩10min。吸取100μL的混合溶膠均勻涂布于載玻片上，于4℃干燥36h，即得到固定化后的小麥酯酶。

1.2.2 小麥酯酶酶活測(cè)定方法 酶活的測(cè)定根據(jù)Asperen［8］等方法改進(jìn)。

1.2.2.1 α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 用3mL不同濃度的α-萘酚溶液與0.5mL 0.8%固蘭B鹽3.5%SDS溶液混合均勻，30℃恒溫水浴5min。用蒸餾水作空白，待1min讀數(shù)穩(wěn)定后595nm處讀取OD值。以吸光度為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2 小麥酯酶酶活的測(cè)定 將酶液按一定比例稀釋?zhuān)?mL稀釋后的酶液加入25μL 0.8mmol/L乙酸α-萘酯丙酮溶液，漩渦振蕩均勻，在30℃恒溫水浴5min。之后加入0.5mL 0.8%固蘭B鹽3.5%SDS溶液，漩渦振蕩均勻，于30℃恒溫水浴5min。用不加乙酸-α-萘酯的反應(yīng)液作空白，待1min讀數(shù)穩(wěn)定后在595nm讀取OD值。根據(jù)下式計(jì)算酶液的活性:

式中:E:小麥酯酶活性(U/mL);C:酶液的稀釋倍數(shù);k:α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率;y:α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距;OD:反應(yīng)液的吸光度;V:反應(yīng)酶液的體積，mL。

1.2.3 生物傳感電極探頭元件的制備 將1mL的TEOS與7.7mL的去離子水按照一定比例混合，加入25μL HCl，120mL甘油溶液(75%)和400mL聚乙烯醇(PVA)溶液(5%)，超聲30min。之后吸取80μL溶膠，加入150μL 10.13%的TritonX-100和162μL 5.80%的PEG-400溶液，漩渦振蕩20min即得到雜化溶膠。

將純化后的小麥酯酶以30mL/g的比例溶解于一定pH6.5的磷酸緩沖溶液(PBS)中，磁力攪拌30min。吸取60μL的酶液加入到雜化溶膠中，旋渦振蕩10min。吸取100μL的混合溶膠均勻涂布于載玻片上，于4℃干燥36h，即得到固定化后的小麥酯酶。

使用前，將其在pH6.5的磷酸鹽緩沖溶液中浸泡10min，再用O型圈將該酶膜固定在球型精密型酸度計(jì)玻璃電極表面，即制成生物傳感電極探頭。

1.2.4 生物傳感電極探頭元件的測(cè)定 移取5.0mL0.001mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.5)于電解池中，插入傳感器和參比電極，加入乙酸-α-萘酯，使其濃度達(dá)到一定濃度，測(cè)量出生物傳感器的初始電位E0，加入適量含有機(jī)磷農(nóng)藥的溶液，溫育一段時(shí)間，然后測(cè)量最終電位E1，則傳感器的抑制率為:

在小麥酯酶的催化作用下，乙酸-α-萘酯水解為α-萘酚和乙酸，這個(gè)過(guò)程的發(fā)生使生物反應(yīng)系統(tǒng)的電位發(fā)生變化，有機(jī)磷農(nóng)藥能強(qiáng)烈地抑制小麥酯酶的催化作用，所以加入有機(jī)磷農(nóng)藥以后，上述反應(yīng)進(jìn)行的程度會(huì)有所降低，溶液中有機(jī)磷農(nóng)藥的濃度越高，反應(yīng)進(jìn)行的程度就會(huì)越慢，電位改變的幅度相應(yīng)就越?。?-10］。通過(guò)建立抑制率和農(nóng)藥濃度間的關(guān)系曲線，可以得出農(nóng)藥的檢測(cè)方程，來(lái)確定農(nóng)藥的濃度［11］。

2 結(jié)果與討論

2.1 α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)ASPEREN等的方法測(cè)得OD值與α-萘酚含量關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

圖1 α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 酶負(fù)載量對(duì)生物傳感電極探頭電位響應(yīng)的影響

將冷凍干燥后不同質(zhì)量的小麥酯酶(1～4g)溶解到30mL的pH6.5的磷酸緩沖溶液(PBS)中，吸取60μL的酶液用溶膠凝膠法固定，測(cè)定底物的電位響應(yīng)［12］。

如圖2所示，當(dāng)酶膜上固定2g小麥酯酶時(shí)，其響應(yīng)的峰電位達(dá)到最大值。但是，當(dāng)進(jìn)一步增加酶的負(fù)載量時(shí)，膜的厚度增加，導(dǎo)致電阻增大，從而該生物傳感器對(duì)乙酸-α-萘酯的響應(yīng)減小。采用含有較低的酶負(fù)載量，有利于減小膜中的擴(kuò)散障礙，實(shí)現(xiàn)對(duì)低濃度農(nóng)藥的動(dòng)力學(xué)控制和高靈敏度。所以采用2g小麥酯酶為每張酶膜上最佳的酶的負(fù)載量。

圖2 小麥酯酶負(fù)載量對(duì)不同濃度乙酸-α-萘酯的電位影響

2.3 溶膠凝膠量與小麥酯酶的體積比對(duì)生物傳感探頭電位響應(yīng)的影響

由于溶膠凝膠法可以很好地保持蛋白質(zhì)表面的微觀結(jié)構(gòu)的整體性和方向一致性，從而對(duì)組分的活性和穩(wěn)定性損傷較小。溶膠凝膠材料的用量和所固定化的小麥酯酶量之比對(duì)測(cè)定電位有著直接的影響。比值少，則固定不牢靠，會(huì)造成測(cè)定過(guò)程中酶的流失［13］;比值大亦會(huì)增大電子轉(zhuǎn)移過(guò)程中的電阻，延長(zhǎng)響應(yīng)時(shí)間。

固定小麥酯酶固定化量2g，改變?nèi)苣z凝膠材料的用量，制備不同溶膠凝膠材料與小麥酯酶體積比的酶膜，用于測(cè)定不同濃度底物的電位響應(yīng)。由圖3確定了最佳的溶膠凝膠與小麥酯酶體積比為0.4。

圖3 溶膠凝膠體積與酶的體積比對(duì)不同濃度乙酸-α-萘酯的穩(wěn)態(tài)電位影響

2.4 緩沖溶液pH對(duì)生物傳感探頭電位響應(yīng)的影響

實(shí)驗(yàn)表明，不同酸度的磷酸鹽緩沖溶液會(huì)影響到傳感器的抑制率［14］(圖4)。同樣測(cè)定5×10-3mol/L的乙酸-α-萘酯，pH在6.5～7.5的范圍內(nèi)，響應(yīng)電位最大，且十分穩(wěn)定。其中過(guò)強(qiáng)的酸堿性對(duì)酶都會(huì)起到破壞作用，同時(shí)由于有機(jī)磷農(nóng)藥在pH＞8時(shí)易發(fā)生水解，圖中在pH＞8時(shí)，響應(yīng)電位的下降可能與此有關(guān)。為了測(cè)定時(shí)既可以獲得較高的靈敏度又防止有機(jī)磷農(nóng)藥水解，故緩沖溶液的pH選取7.0。

2.5 乙酸-α-萘酯濃度對(duì)生物傳感探頭電位響應(yīng)的影響

圖4 pH對(duì)乙酸-α-萘酯響應(yīng)電位的影響

不同濃度的底物對(duì)生物傳感器的響應(yīng)性能會(huì)產(chǎn)生影響［15］(圖5)。實(shí)驗(yàn)表明，底物濃度在0.05～1.6mmol/L范圍內(nèi)，響應(yīng)電位值與底物濃度的對(duì)數(shù)值呈線性關(guān)系，可以在此范圍內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)選用0.8mmol/L作為底物濃度。

圖5 響應(yīng)電位與乙酸-α-萘酯濃度的關(guān)系圖

2.6 溫育時(shí)間對(duì)生物傳感器電位響應(yīng)的影響

兩種有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)小麥酯酶的抑制作用隨著時(shí)間的變化［16］，如圖6。酶的殘留活性在抑制作用開(kāi)始的10min里迅速減小，大約10min抑制作用完成95%。所以在農(nóng)藥的測(cè)定過(guò)程中，溫育時(shí)間選擇為10min。

圖6 小麥酯酶殘留活性隨時(shí)間變化趨勢(shì)

2.7 有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

由于有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)小麥酯酶有抑制作用［17］，這樣將導(dǎo)致在含有農(nóng)藥的基液中的電位發(fā)生變化，電位的變化量與農(nóng)藥的濃度在一定范圍內(nèi)有線性關(guān)系。根據(jù)公式(1)，將電位變化量換算成有機(jī)磷農(nóng)藥的抑制率I，見(jiàn)表1和表2。再以抑制率I對(duì)樂(lè)果和敵百蟲(chóng)兩種常用農(nóng)藥濃度對(duì)數(shù)作圖，如圖7。

表1 樂(lè)果檢測(cè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)換算表

表2 敵百蟲(chóng)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)換算表

圖7 樂(lè)果和敵百蟲(chóng)農(nóng)藥測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線

結(jié)果表明，固定化小麥酯酶對(duì)兩種有機(jī)磷農(nóng)藥的抑制率在其濃度為1×10-8～1×10-3mol/L的范圍內(nèi)成線性關(guān)系。線性方程、相關(guān)系數(shù)R2可求，同時(shí)，對(duì)小于10-8mol/L濃度農(nóng)藥繼續(xù)進(jìn)行檢測(cè)，得出實(shí)際檢測(cè)下限。各種參數(shù)見(jiàn)表3。

表3 兩種有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)參數(shù)

從表3可以看出，雖然敵百蟲(chóng)的抑制曲線相關(guān)系數(shù)優(yōu)于樂(lè)果，但是小麥酯酶對(duì)樂(lè)果的檢測(cè)下限卻要低于敵百蟲(chóng)。這可能是由于小麥酯酶對(duì)敵百蟲(chóng)的選擇性要強(qiáng)于樂(lè)果，而樂(lè)果對(duì)小麥酯酶的抑制性要高于敵百蟲(chóng)的原因。

2.8 有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)曲線的擬合實(shí)驗(yàn)

配制適宜濃度的樂(lè)果和敵百蟲(chóng)溶液噴灑洗凈的白菜后在封閉環(huán)境放置過(guò)夜，取出后剪成1cm2左右的碎片浸入丙酮溶液中振蕩30min過(guò)濾，將所得的兩種農(nóng)藥的丙酮提取液定容至25mL，采用得到的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 真實(shí)樣品中兩種農(nóng)藥的檢測(cè)結(jié)果(n=5)

采用本實(shí)驗(yàn)得出的檢測(cè)曲線檢測(cè)樣品溶液中兩種農(nóng)藥的濃度，測(cè)定5次取平均值，為測(cè)定值。再按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法利用氣相色譜法對(duì)上述兩個(gè)樣品溶液進(jìn)行分析，為加入值，結(jié)果顯示白菜中兩種農(nóng)藥的殘留量加入值分別為樂(lè)果濃度為0.182×10-4mol/L，敵百蟲(chóng)濃度為0.158×10-4mol/L。將用檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的結(jié)果同國(guó)標(biāo)方法相對(duì)照，樂(lè)果的檢測(cè)結(jié)果回收率為真實(shí)值的 88.9%～92.3%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.05%;敵百蟲(chóng)的檢測(cè)結(jié)果回收率為真實(shí)值的87.9%～91.7%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.24%，均在5%以下，表明用本文提出的方法分析蔬菜中的有機(jī)磷農(nóng)殘留與標(biāo)準(zhǔn)方法基本一致，結(jié)果滿意。

2.9 生物傳感電極探頭的半衰期測(cè)定

生物傳感探頭的半衰期取決于電極探頭的使用時(shí)限、酶膜的重復(fù)次數(shù)等因素。但是最重要的是酶膜中固定化小麥酯酶的活性。農(nóng)藥的抑制作用使酶膜中的小麥酯酶活性降低，導(dǎo)致傳感器的靈敏度下降，檢測(cè)數(shù)值不穩(wěn)定，造成誤差。為了恢復(fù)小麥酯酶的活性，把傳感器在1%的2-吡啶醛肟甲基碘化物(2-PAM)溶液或在pH為6.5的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中浸泡10min后相比較，結(jié)果如圖8。

圖8 使用次數(shù)對(duì)酶活保存率的影響

由圖8可以看到，經(jīng)過(guò)2-PAM復(fù)活處理的酶膜中，使用0～6次時(shí)，小麥酯酶的活性始終在95%以上，而用PBS處理過(guò)的酶膜3次使用過(guò)后就在95%以下，隨后急劇下降。由后續(xù)實(shí)驗(yàn)可知，經(jīng)過(guò)2-PAM處理后的酶膜一般可以重復(fù)使用10～20次，在0～13次時(shí)的酶活保存率可恢復(fù)到原來(lái)活性的95%以上，14～20次為初始酶活的90%～95%。經(jīng)浸泡后的電極用緩沖溶液清洗干凈，繼續(xù)使用。而當(dāng)傳感器上的小麥酯酶膜失效，可更換新的小麥酯酶膜，傳感器仍可反復(fù)使用。

3 結(jié)論

3.1 確定了每張酶溶膠凝膠傳感膜上最佳反應(yīng)條件為小麥酯酶的負(fù)載量2g;溶膠凝膠與小麥酯酶體積比0.4;有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)時(shí)體系中緩沖溶液的pH為7.0、乙酸-α-萘酯濃度為 0.8mmol/L、溫育時(shí)間為10min。

3.2 樂(lè)果的濃度在1×10-8～1×10-3mol/L內(nèi)與小麥酯酶的抑制率呈線性關(guān)系，計(jì)算出回歸方程為lgI= 13.02x+118.7，相關(guān)系數(shù)為 0.995，最低檢出限為1.7×10-9mol/L。敵百蟲(chóng)的濃度在 1×10-8～1× 10-3mol/L內(nèi)與小麥酯酶的抑制率呈線性關(guān)系，計(jì)算出回歸方程為y=13.08x+112.7，相關(guān)系數(shù)為0.997，最低檢出限為1.1×10-8mol/L。

3.3 對(duì)照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法得出的結(jié)論，采用檢測(cè)方程得出的樂(lè)果的檢測(cè)結(jié)果回收率為真實(shí)值的88.9%～92.3%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.05%;敵百蟲(chóng)的檢測(cè)結(jié)果回收率為真實(shí)值的87.9%～91.7%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.24%。

3.4 對(duì)酶膜的重復(fù)使用次數(shù)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，得出使用20次以內(nèi)其酶活保存率為初始酶活的90%左右。

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Preparation and application of immobilized wheat esterase biosensors

WANG Hui-you1，WANG Tao1，WANG Zhen-yu1，2，YU Wei1
(1.Department of Food Science，College of Forest，Northeast Forest University，Harbin 150040，China; 2.College of Food，Harbin Institute of Techndogy，Harbin 150086，China)

The immobilized wheat esterase membrane was fixed at the glass electrode precise acidimeter probe to form a biosensor and detected the two kinds of usual organophosphorus pesticides of dimethoate and metrifonate. Result:in the range of dimethoate concentration 1×10-8～1×10-3mol/L，it had linear relation with wheat esterase’s inhibition rate.Regression equation was y=13.02x+118.7，correlation coefficient was 0.995，limit detectability(LDC) was 1.7×10-9mol/L.In the range of metrifonate concentration 1×10-8～1×10-3mol/L，it had linear relation with wheat esterase’s inhibition rate.Regression equation was y=13.08x+112.7，correlation coefficient was 0.997，limit detectability(LDC)was 1.1×10-8mol/L.In the actual sample detection，compared to the national standard method of control，we concluded that the recovery rate of using dimethoate detection equation was 87.9%～92.3%of the true value，and the repeated using number of bio-sensitive membrane resulted that in 20 times using the preserved activity was 90%of initial’s.The biosensors had the capacity of rapidity organophosphorus pesticide detection.

immobilization;wheat esterase;biosensing electrode probe;organophosphorus pesticide

TS210.1

A

1002-0306(2011)03-0385-05

有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥，在我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上被大量使用。但其殘留物毒性較大，人長(zhǎng)期攝入有機(jī)磷農(nóng)藥可導(dǎo)致肝功能下降、血糖升高、白細(xì)胞吞噬功能減退等病理變化，并有致畸、致癌、致突變的作用，嚴(yán)重者可導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能異常，因此有機(jī)磷農(nóng)藥殘留已成為中國(guó)的主要食品安全性問(wèn)題［1-3］。解決此問(wèn)題主要依靠建立一種準(zhǔn)確快速、簡(jiǎn)單廉價(jià)的農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù)，這已經(jīng)成為食品安全和環(huán)境保護(hù)的當(dāng)務(wù)之急。傳統(tǒng)的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法主要是色譜法，該法雖然測(cè)定精確、靈敏度高，但樣品前處理復(fù)雜，儀器龐大，設(shè)備昂貴，手續(xù)復(fù)雜，需專(zhuān)業(yè)人員進(jìn)行操作，因此不適于經(jīng)常性的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。而二十世紀(jì)六十年代以后迅速發(fā)展起來(lái)的生物傳感檢測(cè)技術(shù)以其快速、簡(jiǎn)便、適合現(xiàn)場(chǎng)操作等特性滿足了對(duì)食品檢驗(yàn)的要求［4-5］。由于大部分的生物傳感器都是由生物敏感膜和龐大的數(shù)據(jù)信號(hào)轉(zhuǎn)換裝置相連接所組成的，如熒光監(jiān)測(cè)儀，光纖探測(cè)器等，所以此類(lèi)生物傳感器并不適合有機(jī)磷農(nóng)藥真正的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)［6-7］。而采用精密型酸度計(jì)作為信號(hào)的轉(zhuǎn)換儀器，則可以很好地縮小檢測(cè)設(shè)備的體積，更加方便地進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。本文對(duì)固定化小麥酯酶生物傳感器電極探頭的制備進(jìn)行了研究，將生物敏感膜與精密型酸度計(jì)的玻璃探頭進(jìn)行組裝，檢測(cè)時(shí)通過(guò)有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)小麥酯酶的抑制程度與有機(jī)磷農(nóng)藥濃度間的關(guān)系反映有機(jī)磷農(nóng)藥的含量。同時(shí)，對(duì)檢測(cè)時(shí)的幾個(gè)重要參數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，找出了最佳的反應(yīng)條件，為其在實(shí)際應(yīng)用中提供一定的數(shù)據(jù)支持和參考依據(jù)。

2010-03-12

王會(huì)友(1982-)，男，碩士研究生，研究方向:生物技術(shù)及功能性食品開(kāi)發(fā)。

東北林業(yè)大學(xué)研究生科技創(chuàng)新資助項(xiàng)目。