孟宇航 鄧書 李光華 （山東省即墨市畜牧獸醫(yī)局 266200 青島誠(chéng)譽(yù)食品檢測(cè)有限公司）

?

兩例鴨禽霍亂的診斷試驗(yàn)

孟宇航①鄧書②李光華①（①山東省即墨市畜牧獸醫(yī)局 266200 ②青島誠(chéng)譽(yù)食品檢測(cè)有限公司）

本試驗(yàn)依據(jù)家禽(畜)流行病診斷的基本原理和方法，通過試驗(yàn)臨床癥狀觀察和病理解剖觀察到的特征性病理變化，作出初步診斷；再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室的病原生物學(xué)檢查，病原的分離與純化，動(dòng)物回歸試驗(yàn)和生化試驗(yàn)作出確診，并以藥敏試驗(yàn)的結(jié)果為依據(jù)提出治療本病的合理治療方案，以防止因菌株對(duì)所使用藥物產(chǎn)生的耐藥性而影響治療效果。

禽霍亂 巴氏桿菌 生物學(xué)檢查

隨著人民生活水平的提高和對(duì)畜產(chǎn)品需求量的不斷增加，集約化養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展也愈來愈迅速。但是在發(fā)展集約化規(guī)模養(yǎng)殖的過程中，各種傳染病的危害也愈來愈嚴(yán)重。本試驗(yàn)結(jié)合當(dāng)前養(yǎng)禽業(yè)面臨的實(shí)際問題，主要研究鴨禽霍亂的診斷，對(duì)實(shí)際工作進(jìn)行正確診斷具有一定的參考意義。

禽霍亂的流行特點(diǎn)是對(duì)各種家禽包括雞、鴨、鵝和火雞都有易感性。在鴨群中常呈流行性，1月齡以內(nèi)雛鴨發(fā)病率和死亡率均高，而成鴨則較低。病禽和帶菌禽是本病的傳染源。病禽的各種臟器、分泌物、排泄物，以及被其污染的飼料、飲水、場(chǎng)地、用具，各種動(dòng)物、人和機(jī)械，某些昆蟲、寄生蟲等都可以是本病的傳播媒介。禽舍不潔、潮濕擁擠、氣候突變、飼養(yǎng)失調(diào)、長(zhǎng)途運(yùn)輸和患寄生蟲病等均可誘發(fā)本病流行[1,2]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、器材 試驗(yàn)用鴨：共2組，取自即墨周邊地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)(戶)；家兔：3只，購(gòu)自即墨；高壓鍋，37℃恒溫箱，4℃冰箱，酒精燈，試管，玻片，培養(yǎng)皿，酒精棉球，碘酒，剪子等。

1.1.2 試劑 基礎(chǔ)培養(yǎng)基原料：牛肉膏，蛋白胨，氯化鈉，瓊脂，蒸餾水[3]，犢牛血清

1.2 試驗(yàn)準(zhǔn)備

（1）清洗20副培養(yǎng)皿，一個(gè)20 ml的針筒，一支16號(hào)針頭，用潔凈報(bào)紙包好后高壓蒸汽滅菌(121℃，15min)，待用。（2）購(gòu)家兔2只。（3）基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備。（4）鮮血瓊脂平板的制備。預(yù)先將經(jīng)高壓蒸汽滅菌的平皿，酒精燈放入細(xì)菌實(shí)驗(yàn)專用操作柜作柜中；再將已冷卻的基礎(chǔ)培養(yǎng)基加熱融化并冷卻至50℃，以無菌操作法取家兔心血20ml注入基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶液中，在細(xì)菌實(shí)驗(yàn)專用操作柜作柜中搖勻并以無菌方法迅速倒平板；待鮮血平板冷卻后，將其倒置平放于37℃溫箱中培養(yǎng)24h，觀察，無細(xì)菌生長(zhǎng)，說明鮮血平板未被污染，可繼續(xù)用于巴氏桿菌的分離與純化試驗(yàn)。平板從溫箱中取出后置于4℃冰箱中待用。

1.3 操作方法

1.3.1 病理解剖 將疑似禽霍亂病鴨(共2組, 已死亡)做病理解剖，仔細(xì)檢查各內(nèi)臟器官的病理變化。

1.3.2 涂片鏡檢 病理解剖后，各取一小片肝臟和心臟觸片，分別用瑞士染色法和革蘭氏染色法染色后觀察細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)和染色特性。

1.3.3 細(xì)菌的分離與純化 分別自第1，2組病鴨的肝臟挑取細(xì)菌接種于鮮血瓊脂平板，置37℃溫箱中培養(yǎng)24h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。在長(zhǎng)出菌落的培養(yǎng)基中，挑取半個(gè)菌落抹片，用革蘭氏染色和瑞士染色法染色后觀察細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)和染色特性。

1.3.4 動(dòng)物試驗(yàn) （1）將取自第1組病料的細(xì)菌純培養(yǎng)物接種血清肉湯，于37℃溫箱中培養(yǎng)24h后，給家兔注射0.5ml，觀察24~48h。（2）將取自第2組病鴨的肝臟，取一片搗碎后加生理鹽水制成懸液，靜置后取上清液1ml注射家兔，觀察24~48h。（3）將1ml生理鹽水注射陰性對(duì)照家兔，觀察24~48h。（4）對(duì)動(dòng)物試驗(yàn)中死亡的家兔進(jìn)行病理解剖，并取病變部位材料涂片鏡檢。

1.3.5 藥敏實(shí)驗(yàn) （1）血清肉湯培養(yǎng)基的制備：先配制50ml肉湯培養(yǎng)基。高壓滅菌后，以10:1的比例加入5ml犢牛血清。在微生物實(shí)驗(yàn)專用操作柜中以無菌方法分裝試管，共分裝6支試管。（2）接種血清肉湯：從兩組病料接種的鮮血瓊脂平板上挑取單個(gè)菌落，分別接種3支血清肉湯試管。（3）將接種好的血清肉湯培養(yǎng)基置于37℃溫箱中培養(yǎng)24h。（4）藥敏試驗(yàn)：以無菌棉球蘸取血清肉湯培養(yǎng)物均勻涂抹于鮮血瓊脂平板上，分別在每個(gè)平板中放入5個(gè)藥敏片，置于37℃溫箱中培養(yǎng)24h并觀察結(jié)果。

1.3.6 生化試驗(yàn) 以無菌操作方法，挑取單一菌落分別接種于如下微量生化試管：過氧化氫酶、氧化酶、尿素、甘露醇。觀察并記錄結(jié)果。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 試驗(yàn)觀察記錄

2.1.1 病理變化 病理特征有：冠、肉垂黑紫色，胸肌和胸漿膜散在出血點(diǎn)。心包積多量漿液，心外膜出血明顯。肝腫脹、棕黃色、質(zhì)脆，散在大量的灰白色壞死點(diǎn)。肺有點(diǎn)狀出血和暗紅色肝變區(qū)。十二指腸呈嚴(yán)重的出血性炎癥變化，腸腔擴(kuò)張，漿膜血管明顯，并見出血斑點(diǎn)；腸內(nèi)容物血樣、粥狀；黏膜高度充血、出血。

2.1.2 鏡檢結(jié)果 分別取第1、2組病鴨的肝臟、心臟觸片，用瑞士染色法染色后，觀察到大量?jī)蓸O濃染、中部略空的球桿狀細(xì)菌。做革蘭氏染色后觀察到大量革蘭氏陰性桿菌。

2.1.3 分離培養(yǎng)結(jié)果 兩組病料接種的鮮血平板上均長(zhǎng)出水滴樣小菌落，無溶血現(xiàn)象。挑取單個(gè)菌落抹片后作瑞士染色和革蘭氏染色，觀察到兩極濃染的革蘭氏陰性球桿菌。

2.1.4 動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果 第1組死亡；第2組死亡；陰性對(duì)照組存活。

對(duì)死亡的家兔作病理解剖，均可觀察到肝臟有大量灰色壞死點(diǎn)，取一小片肝臟觸片鏡檢，觀察到兩極濃染的革蘭氏陰性球桿菌。

2.1.5 生化試驗(yàn)結(jié)果 (見表1)

表1 生化試驗(yàn)結(jié)果

2.1.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 (見表2)

2.2 診斷結(jié)論

（1）從病理解剖的結(jié)果看，各病變特征均符合禽霍亂的病理要求，其特征性病變有肝臟有灰白色針尖狀小點(diǎn)，據(jù)此可以初步診斷為禽霍亂。（2）從涂片、鏡檢、分離培養(yǎng)以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所觀察到的病原微生物特征，皆可確診為禽多殺性巴氏桿菌，據(jù)此可確診兩株是禽霍亂。（3）生化試驗(yàn)結(jié)果表明兩株細(xì)菌確系巴氏桿菌。從藥敏試驗(yàn)結(jié)果來看，此兩株細(xì)菌對(duì)多種抗生素及磺胺類藥物高度敏感，這些藥物均可有效地治療本病。（4）綜上所述，對(duì)兩組鴨分別進(jìn)行了病理學(xué)診斷和病原學(xué)診斷，確診為禽霍亂。故可根據(jù)防制禽霍亂的基本方法進(jìn)行防制，并可根據(jù)本試驗(yàn)中藥敏試驗(yàn)的結(jié)果提供治療措施。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果抑菌圈直徑 (mm)

3 討論

（1）本病一年四季均可發(fā)生，氣候劇變、高溫潮濕、多雨、飼養(yǎng)管理不良等因素常促進(jìn)該病的發(fā)生和流行。在診斷過程中，要結(jié)合多方面的因素，綜合考慮而作出診斷結(jié)論。（2）禽霍亂的病原為多殺性巴氏桿菌，為細(xì)小球桿菌。根據(jù)巴氏桿菌特異性莢膜抗原的不同，分為A，B，C，D，E和F5個(gè)血清型，禽霍亂主要屬于A型，亦見于D型。（3）在動(dòng)物試驗(yàn)中，對(duì)死亡的家兔作病理解剖，觀察到肝臟有大量灰色壞死點(diǎn)。取一小片肝臟觸片鏡檢，觀察到兩極濃染的革蘭氏陰性球桿菌，為確診禽霍亂提供了重要依據(jù)。（4）目前，在禽霍亂的治療方面存在盲目用藥的現(xiàn)象，因此，常出現(xiàn)在使用抗生素類藥物治療本病時(shí)，不能取得預(yù)期效果。而結(jié)合本場(chǎng)次的流行菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果選用有針對(duì)性的高敏藥物，可有效解決這一問題。（5）在傳染病的診斷過程中，要防止唯病原論觀點(diǎn)。在本次試驗(yàn)中，雖然觀察到革蘭氏陰性，兩極濃染的球桿菌，但也不排除存在混合感染的可能性。同時(shí)要注意不同疫病間的鑒別診斷，應(yīng)將本病與鴨疫里氏桿菌病、鴨大腸桿菌病、鴨病毒性肝炎、鴨沙門氏菌病等進(jìn)行鑒別。（6）在鴨禽霍亂的防制方面，加強(qiáng)鴨群的飼養(yǎng)管理，平時(shí)嚴(yán)格執(zhí)行鴨場(chǎng)獸醫(yī)衛(wèi)生防疫措施，以棟舍為單位采取全進(jìn)全出的飼養(yǎng)制度，對(duì)預(yù)防本病的發(fā)生是完全有可能的，一般從未發(fā)生本病的鴨場(chǎng)不進(jìn)行疫苗接種。如發(fā)生本病，立即對(duì)鴨群進(jìn)行封鎖、隔離、檢疫和消毒，對(duì)假定健康鴨，用禽霍亂抗血清進(jìn)行緊急預(yù)防注射。

[1] 甘孟侯,蔣金書. 畜禽群發(fā)病防治[M]. 第2版. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社, 1998.

[2]中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所. 動(dòng)物傳染病學(xué)[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 1998.

[3]姚火春. 獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 第2版. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社. 1998.

[4]陳天壽. 微生物培養(yǎng)基的制造與應(yīng)用[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1995.

[5]趙斌, 何少江. 生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2002.

[6]蔡寶祥. 獸醫(yī)傳染病學(xué)[M]. 第3版. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2001.

[7]北京農(nóng)業(yè)大學(xué). 動(dòng)物生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社 2000.

（2010–11–23）

S858.32

A

1007-1733(2011)02-0010-03