王偉飛 王新穎 岳 輝 毛正果 陳培生

大腸癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在全世界范圍內(nèi)，大腸癌的發(fā)病率男女均處于惡性腫瘤的第3位［1］，在我國(guó)，大腸癌的發(fā)病呈逐年上升趨勢(shì)。研究表明，大腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)典型的多基因多步驟的癌變過(guò)程［2］。CD24是1種黏蛋白樣高度糖基化的膜表面黏附分子，近年研究發(fā)現(xiàn)其在多種造血系統(tǒng)腫瘤及實(shí)體瘤中呈高表達(dá)［3］，而且CD24的胞質(zhì)表達(dá)與乳腺癌［4］、膽管癌［5］、胃癌［6］、腎透明細(xì)胞癌［7］及前列腺癌［8］等腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)。在大腸癌中，90.7%腺瘤和86.3%腺癌表達(dá)CD24［9］，這提示在大腸癌的早期階段已經(jīng)發(fā)生CD24的改變，說(shuō)明CD24可能參與大腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。因此，本研究檢測(cè)CD24在大腸癌組織及細(xì)胞株中的表達(dá)情況，并通過(guò)構(gòu)建CD24真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒，初步探討CD24對(duì)大腸癌SW480細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣本 收集我院 2007年7月～2008年12月、手術(shù)切除并經(jīng)病理檢查證實(shí)的大腸癌及癌旁組織標(biāo)本106例，所有病例均經(jīng)病理檢查確診，且排除合并有其它惡性腫瘤和手術(shù)前接受化療或放療的患者。全部病例中，男性65例，女性41例，年齡26～87歲，中位年齡59歲。按WHO腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)(大腸癌)進(jìn)行組織學(xué)分型:高分化腺癌23例，中分化腺癌70例，低分化腺癌13例。按國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)和美國(guó)腫瘤聯(lián)合會(huì)(AJCC)聯(lián)合制定的標(biāo)準(zhǔn)(2003年)進(jìn)行TNM分期:Ⅰ期16例，Ⅱ期37例，Ⅲ期37例，Ⅳ期16例。

1.1.2 細(xì)胞株及試劑 大腸癌細(xì)胞株 SW1116、SW480、SW620、HCT8、LoVo及 Colo205 為本實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存，RPMI 1640及胰酶購(gòu)自GIBCO公司，胎牛血清及青鏈霉素購(gòu)自杭州四季青生物公司，Trizol、pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 2000均購(gòu)自invitrogen公司，RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自立陶宛MBI(Fermentas)公司，PCR反應(yīng)體系購(gòu)自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司，正常腸組織cDNA文庫(kù)由南方醫(yī)院消化內(nèi)科王繼徳教授贈(zèng)送，核酸純化試劑盒購(gòu)自德國(guó)Macherey-Nagel(MN)公司，內(nèi)切酶EcoRⅠ和KpnⅠ及連接酶購(gòu)自美國(guó)NEB公司，感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，CD24 Ab-1(Clone SN3)單克隆抗體購(gòu)美國(guó) Neomarker公司，CD24(C-20)和FITC標(biāo)記的二抗購(gòu)自美國(guó)Santa cruz公司，HRP標(biāo)記二抗均購(gòu)自武漢博士德生物公司，細(xì)胞增殖試劑盒CCK8購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所，免疫組化用SP試劑盒、DAB顯色試劑盒和防脫玻片購(gòu)自福州邁新生物公司。

1.2 方法

1.2.1 CD24表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù) GenBank中人CD24基因(基因編號(hào):NM 013230)設(shè)計(jì)引物，以正常腸黏膜cDNA文庫(kù)為模板擴(kuò)增cDNA編碼區(qū)，上下游引物分別是5’-TAGGTACCACTATGGGCAGAGCAATGG-3’(F)和 5’-CCGGAATTCCGTTAAGAGTAGAGATGC-3’(R)，PCR反應(yīng)體系為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，54℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，36個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物及空質(zhì)粒按說(shuō)明書(shū)使用EcoRⅠ和kpnⅠ雙酶切后純化連接，之后進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑單克隆增菌后提取質(zhì)粒，雙酶切及測(cè)序鑒定。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 上述大腸癌細(xì)胞株使用含100 ml/L胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2飽和濕度孵箱內(nèi)孵育。細(xì)胞生長(zhǎng)至約85%融合時(shí)使用胰酶(0.05%，w/v)/EDTA(0.02%，w/v)進(jìn)行傳代。細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作按Lipofectmine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，在六孔板上轉(zhuǎn)染4 μg質(zhì)粒，對(duì)照組轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1(+)，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-CD24。轉(zhuǎn)染后48 h處理細(xì)胞，應(yīng)用RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行鑒定。

1.2.3 RT-PCR分析 收集的細(xì)胞用冰預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗3遍后，按Trizol的說(shuō)明書(shū)提取總RNA，采用分光光度計(jì)進(jìn)行定量，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，36個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃終止反應(yīng)。CD24的上下游引物分別為5’-GACATGG GCAGAGCAATGGTGGC-3’(F)和 5’-GAGTGAGACCACGAAGAGACTGGC-3’(R)［10］。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，同時(shí)擴(kuò)增 GADPH 作為內(nèi)參照。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù) 0.05%胰酶消化細(xì)胞，按2×105個(gè)/ml的密度重懸細(xì)胞，按1∶100的工作濃度加入CD24 單克隆抗體(Ab-1，Neomarker)，冰上孵育 1h，用含有3%FBS的PBS緩沖液洗滌2次后，按1∶200的工作濃度加入FITC標(biāo)記的二抗，冰上40 min，洗滌重懸后用流式細(xì)胞儀分析。同時(shí)以同型IgG作為陰性對(duì)照。

1.2.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 0.25%胰蛋白酶消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480細(xì)胞、SW480-Vector細(xì)胞和SW480-CD24細(xì)胞后，用培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液(3×105個(gè)/ml)，接種于 96 孔培養(yǎng)板中(100 μl/孔)，分別在轉(zhuǎn)染0、24、48、72、96 h時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。每組各設(shè) 6孔，在檢測(cè)時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)加入CCK-8(5 mg/ml)10 μl/孔，37 ℃孵育培養(yǎng)2 h后，應(yīng)用酶聯(lián)免疫標(biāo)記分析儀測(cè)定，用只加培養(yǎng)基的空白對(duì)照孔進(jìn)行調(diào)零，每孔450 nm波長(zhǎng)的吸光度OD值(OD450)，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫軸、吸光值為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判定 上述標(biāo)本離體后經(jīng)10%中性福爾馬林液固定24～48 h，取材，常規(guī)脫水、透明和包埋，切片，厚度為4 μm，組織蠟片置于預(yù)先涂有多聚賴氨酸的載玻片烤干備用。采用免疫組化SP方法，按照免疫組織化學(xué)常規(guī)步驟操作。一抗CD24(C-20)按1∶400稀釋后4℃過(guò)夜。用已知陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

CD24陽(yáng)性表達(dá)者細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒。判定標(biāo)準(zhǔn):每張切片隨機(jī)選取5個(gè)不同高倍視野(400×)進(jìn)行觀察。染色結(jié)果綜合染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)兩個(gè)方面進(jìn)行半定量分析。指標(biāo)染色強(qiáng)度判定:無(wú)染色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，黃褐色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)判定:陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)＜5%為0分，5% ～25%為1分，26% ～75%為2分，＞75%為3分。將染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分值相加即為切片各指標(biāo)最終得分:0～1分為陰性(－)，2分為弱陽(yáng)性(+)，3～4分為陽(yáng)性(+ +)，5～6分為強(qiáng)陽(yáng)性(+ + +)。所有切片采用雙盲法，由兩位病理科醫(yī)師獨(dú)立閱片評(píng)分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果均應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果取3次結(jié)果的平均值，增殖實(shí)驗(yàn)取3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的1次作為統(tǒng)計(jì)結(jié)果，采用析因設(shè)計(jì)的方差分析;免疫組化中CD24染色強(qiáng)度(等級(jí)資料)與患者性別、年齡和腫瘤部位的關(guān)系分析采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，而表達(dá)強(qiáng)度與TNM分期和腫瘤分級(jí)的關(guān)系分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 CD24在大腸癌組織中的表達(dá)

CD24在大腸癌組織中的染色定位在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒樣染色，而在癌旁正常黏膜中幾乎無(wú)染色。CD24膜表達(dá)陽(yáng)性率為34.9%，表達(dá)水平與腫瘤分級(jí)呈負(fù)相關(guān)(γ = －0.201，P=0.038)，而與患者性別、年齡及腫瘤分期無(wú)相關(guān)性(表1)。CD24質(zhì)表達(dá)陽(yáng)性率為89.6%，其表達(dá)水平與腫瘤分級(jí)(γ=0.235，P=0.015)和腫瘤分期(γ =0.269，P=0.005)呈正相關(guān)性，與患者性別、年齡及腫瘤部位無(wú)相關(guān)性(表2)。

2.2 CD24在大腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)

采用 RT-PCR法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CD24在 SW620和Colo205細(xì)胞中呈高表達(dá)，在SW1116細(xì)胞中呈中度表達(dá)，而在SW480、HCT8和LoVo細(xì)胞中幾乎無(wú)表達(dá)。進(jìn)一步應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)從蛋白質(zhì)水平檢測(cè)CD24的表達(dá)，其結(jié)果與采用RT-PCR法檢測(cè)的結(jié)果一致。

2.3 構(gòu)建CD24表達(dá)質(zhì)粒并瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞

對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切(EcoRI和KpnI)，得到265 bp的片段，與預(yù)計(jì)片段大小一致，而空載體沒(méi)有相應(yīng)條帶(圖1A);質(zhì)粒測(cè)序證實(shí)重組質(zhì)粒插入片段與Genebank的序列完全一致。上述結(jié)果提示CD24在SW480細(xì)胞中呈低表達(dá)，故選擇轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞使其過(guò)表達(dá)CD24，同時(shí)轉(zhuǎn)染空載體作為陰性對(duì)照。如圖1B所示，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果提示，CD24在重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中呈高表達(dá)，而在空白對(duì)照組和空載體組中呈低表達(dá)。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，CD24重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組在蛋白質(zhì)水平也呈明顯的高表達(dá)(圖1C)。

表1 CD24膜表達(dá)與大腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例，%)

表2 CD24質(zhì)表達(dá)與大腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例，%)

圖1 構(gòu)建pcDNA3.1(+)-CD24表達(dá)質(zhì)粒并瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞

2.4 CCK-8法檢測(cè)大腸癌細(xì)胞的增殖情況

增殖實(shí)驗(yàn)分為轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染空載體組(陰性對(duì)照組)和試劑組(空白對(duì)照組)，分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72、96 h應(yīng)用 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活性情況。結(jié)果提示，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染48、72和96 h時(shí)，活性均較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組明顯增強(qiáng)(P＜0.001)(圖2)，提示CD24促進(jìn)大腸癌SW480細(xì)胞的增殖。

圖2 CD24促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的增殖曲線圖

3 討論

CD24通過(guò)糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定在細(xì)胞膜上，具有多個(gè)N-或O-連接的糖基化位點(diǎn)。而且，CD24分子在進(jìn)化中獲得了更多的絲氨酸和蘇氨酸殘基，使其成為更典型的黏蛋白樣膜表面黏附分子［3］。P-選擇素是CD24已經(jīng)被識(shí)別的唯一配體［11］，它主要表達(dá)在激活的內(nèi)皮細(xì)胞和血小板上［12］。在生理狀態(tài)下，CD24通過(guò)和P-選擇素結(jié)合促進(jìn)腫瘤細(xì)胞黏附在血管內(nèi)皮細(xì)胞上［13］，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在肺部形成轉(zhuǎn)移灶［14］。因此，CD24的結(jié)構(gòu)決定其與腫瘤細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

在本研究中，我們應(yīng)用免疫組化方法，檢測(cè)大腸癌及癌旁正常組織中CD24的表達(dá)情況，結(jié)果表明，CD24在大腸癌組織中呈高表達(dá)，質(zhì)表達(dá)和膜表達(dá)陽(yáng)性率分別為89.6%和34.9%，而在癌旁正常黏膜中幾乎沒(méi)有表達(dá)。而且，CD24的質(zhì)表達(dá)水平與腫瘤分級(jí)分期呈正相關(guān)關(guān)系。這表明CD24在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用。

Baumann等［15］發(fā)現(xiàn)高表達(dá)CD24不僅促進(jìn)乳腺癌和胰腺癌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附、遷移和侵襲，而且，體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)都顯示其促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。Smith等［16］應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)降低CD24的表達(dá)后，膀胱癌、前列腺癌和乳腺癌細(xì)胞的增殖明顯受到抑制。在本研究中，為了進(jìn)一步驗(yàn)證CD24對(duì)大腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，我們構(gòu)建了CD24的表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3.1(+)-CD24，并選擇 CD24低表達(dá)的SW480細(xì)胞作為轉(zhuǎn)染對(duì)象。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)CD24后SW480細(xì)胞在體外的生長(zhǎng)和增殖明顯加快，這說(shuō)明CD24不僅與腫瘤的遷移和黏附有關(guān)，而且，與腫瘤細(xì)胞的增殖也密切相關(guān)。但是，CD24促進(jìn)癌細(xì)胞增殖的機(jī)制并不清楚。Kim等［17］發(fā)現(xiàn)CD24對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖作用可能與CyclinD1和p27有關(guān)。連續(xù)切片的免疫組化染色表明，在膽管癌組織中CD24表達(dá)與p-MAPK呈明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系［5］。這些研究說(shuō)明CD24可能通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的某些信號(hào)分子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖作用。

總之，本研究表明CD24在大腸癌的組織中呈高表達(dá)，而且可促進(jìn)大腸癌細(xì)胞在體外的增殖作用，這說(shuō)明CD24在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用。但是，其發(fā)生作用的具體機(jī)制并不清楚，包括相互作用的分子、結(jié)構(gòu)以及與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的關(guān)系，因此，需要進(jìn)一步深入研究。

［1］Peto J.Cancer epidemiology in the last century and the next decade〔J〕.Nature，2001，411(6835):390.

［2］Arnold C，Goel A，Blum H，et al.Molecular pathogenesis of colorectal cancer:implications for molecular diagnosis〔J〕.Cancer，2005，104(10):2035.

［3］Kristiansenl G，Sammar M，Altevogt P.Tumour biological aspects of CD24，a mucin-like adhesion molecule〔J〕.J Mol Histo，2004，35(3):255.

［4］Kristiansen G，Winzer K，Mayordomo E，et al.CD24 expression is a new prognostic marker in breast cancer〔J〕.Clin Cancer Res，2003，9(13):4906.

［5］Agrawal S，Kuvshinoff B，Khoury T，et al.CD24 expression is an independent prognostic marker in cholangiocarcinoma〔J〕.J Gastrointest Surg，2007，11(4):445.

［6］Chou Y，Jeng Y，Lee T，et al.Cytoplasmic CD24 expression is a novel prognostic factor in difuse-type gastric adenocarcinoma〔J〕.Ann Surg Oncol，2007，14(10):2748.

［7］Lee H，Kim D，Kwak C，et al.Expression of CD24 in clear cell renal cell carcinoma and its prognostic significance〔J〕.Urology，2008，72(3):603.

［8］Kristiansen G，Pilarsky C，Pervan J，et al.CD24 Expression is a significant predictor of PSA relapse and poor prognosis in low grade or organ confined prostate cancer〔J〕.Prostate，2004，58(2):183.

［9］Sagiv E，Memeo L，Karin A，et al.CD24 is a new oncogene，early at the multistep process of colorectal cancer carcinogenesis〔J〕.Gastroenterology，2006，131(2):630.

［10］Tsuyoshi F，Tomoaki T，Takeshi S，et al.Silencing of insulin-like growth factor-binding protein-2 in human glioblastoma cells reduces both invasiveness and expression of progression-associated gene CD24〔J〕.J Biol Chem，2007，282(25):18634.

［11］Aigner B，Sthoeger Z，F(xiàn)ogel M，et al.CD24，a mucin-type glycoprotein，is a ligand for P-selectin on human tumor cells〔J〕.Blood，1997，89(9):3385.

［12］Walz G，Aruffo A，Kolanus W，et al.Recognition by ELAM-1 of the sialyl-Lex determinant on myeloid and tumor cells〔J〕.Science，1990，250(4984):1132.

［13］Aigner S，Ramos C，Hafezi-Moghadam A，et al.CD24 mediates rolling of breast carcinoma cells on P-selectin〔J〕.FASEB J，1998，12(12):1241.

［14］Friederichs J，Zeller Y，Hafezi-Moghadam A，et al.The CD-24/P-selectin binding pathway initiates lung arrest of human A125 adenocarcinoma cells〔J〕.Cancer Res，2000，60(12):6714.

［15］Baumann P，Cremers N，Kroese F，et al.CD24 expression causes the acquisition of multiple cellular properties associated with tumor growth and metastasis〔J〕.Cancer Res，2005，65(23):10783.

［16］Smith S，Oxford G，Wu Z，et al.The metastasis-associated gene CD24 is regulated by Ral GTPase and is a mediator of cell proliferation and survival in human cancer〔J〕.Cancer Res，2006，66(4):1917.

［17］Kim H，Kim J，Lee K，et al.Isolation of CD24(high)and CD24(low/-)cells from MCF-7:CD24 expression is positively related with proliferation，adhesion and invasion in MCF-7〔J〕.Cancer Lett，2007，258(1):98.