歐巧明 倪建福 崔文娟 龐斌雙

(甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所1,蘭州 730070)

(北京市農(nóng)林科學(xué)院雜交小麥工程技術(shù)研究中心2,北京 100089)

高粱 DNA 導(dǎo)入引起小麥 HMW-GS的 變異及其品質(zhì)改良和變異機(jī)理分析

歐巧明1倪建福1崔文娟1龐斌雙2

(甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所1,蘭州 730070)

(北京市農(nóng)林科學(xué)院雜交小麥工程技術(shù)研究中心2,北京 100089)

采用花粉管通道法,將高粱 (Sorghum bicolor L.)基因組 DNA導(dǎo)入粉質(zhì)籽粒的穩(wěn)定品系 89122中,后代經(jīng)多代連續(xù)選擇優(yōu)良變異系,并進(jìn)行了高分子質(zhì)量麥谷蛋白亞基的 SDS-PAGE電泳檢測(cè)和品質(zhì)化驗(yàn)分析。獲得 1個(gè)穩(wěn)定遺傳變異新品種,與導(dǎo)入受體 89122相比,后代新品系 2001502-23含有 7+8、5+10優(yōu)質(zhì)亞基,HMW-GS發(fā)生明顯變異,GulD1位點(diǎn)基因發(fā)生等位變異,其表達(dá)產(chǎn)物由原來(lái) (89122)的 2+12亞基為 5+10亞基;其品質(zhì)指標(biāo)較受體得到改善,從而實(shí)現(xiàn)了受體小麥 HMW-GS基因的遺傳轉(zhuǎn)化和品質(zhì)改良。說(shuō)明利用花粉管通道法完全可以實(shí)現(xiàn)小麥 HMW-GS基因的轉(zhuǎn)化和品質(zhì)目標(biāo)性狀的遺傳改良。而生物誘變是其可能的遺傳轉(zhuǎn)化和變異機(jī)理之一。

小麥 高粱 DNA 花粉管通道法 高分子質(zhì)量谷蛋白亞基 (HMW-GS) 等位變異

國(guó)內(nèi)小麥品種麥谷蛋白亞基是改善烘烤品質(zhì)的限制因子,其中 Glu-D1位點(diǎn)的品質(zhì)效應(yīng)來(lái)源于 5+10亞基與 2+12亞基之間的差異,5+10亞基取代 2+12亞基將可能改善小麥的烘烤品質(zhì)[1-3]。近年來(lái),小麥品質(zhì)的遺傳改良愈加被重視。有計(jì)劃的常規(guī)/遠(yuǎn)緣雜交和系統(tǒng)選育等作為主要手段在小麥品種改良中發(fā)揮了重要作用,但這也使得小麥的遺傳基因資源愈加狹窄,其品質(zhì)改良也受到很大限制[4]?；ǚ酃芡ǖ婪ń閷?dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化等分子育種技術(shù)為小麥品質(zhì)改良提供了新的途徑。

已有的研究結(jié)果表明,花粉管通道法介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化及其后代能產(chǎn)生變異,已相繼在 40多種作物上取得了顯著成效[5-6];在國(guó)外 SCI/EI期刊也相繼出現(xiàn)報(bào)道[6-10],并已獲得大量?jī)?yōu)良小麥[11-14]新品種。利用花粉管通道法將多種異源基因組 DNA導(dǎo)入春小麥,成功實(shí)現(xiàn)了小麥的遺傳改良[4,12,15-16]。其中將高粱基因組 DNA導(dǎo)入受體甘麥 8號(hào),經(jīng)高分子質(zhì)量麥谷蛋白亞基 (HMW-GS)SDS-PAGE電泳檢測(cè),后代 89144的 HMW-GS發(fā)生了突變,由受體的2+12亞基變?yōu)?5+10亞基,其他幾個(gè)轉(zhuǎn)基因后代與其受體相比,HMW-GS雖未發(fā)生變化,但各亞基的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)有較大變化,實(shí)現(xiàn)了小麥 HMW-GS基因的轉(zhuǎn)化和品質(zhì)性狀的遺傳改良[4]。可見(jiàn),在普通小麥優(yōu)良谷蛋白基因缺乏的情況下,采用花粉管通道法、分子標(biāo)記等分子育種技術(shù)進(jìn)行小麥品質(zhì)改良是完全可行的。

本研究擬采用花粉管通道法,將高粱 (Sorghum bicolorL.)基因組 DNA導(dǎo)入粉質(zhì)籽粒的穩(wěn)定品系89122,對(duì)其品質(zhì)進(jìn)行改良,并對(duì)其后代進(jìn)行 HMWGS檢測(cè)和品質(zhì)化驗(yàn)分析,以期引入普通小麥缺乏的優(yōu)良品質(zhì)性狀基因,在品質(zhì)育種方面更加突出目標(biāo)性狀的遺傳改良,創(chuàng)造特異新種質(zhì)和優(yōu)良新品種,也為外源DNA導(dǎo)入創(chuàng)造優(yōu)良新品種等相關(guān)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 供試材料

外源 DNA供體:高粱 6A/115(Sorghum bicolor L.),禾本科高粱屬,一年生草本,體細(xì)胞染色體數(shù)目2n=20,生育期 130 d,分蘗旺盛,抗逆性強(qiáng),適應(yīng)性廣[17]。由甘肅省農(nóng)科院生物技術(shù)研究所引種。

受體材料:89122,甘肅省春小麥品種,2n=42,籽粒粉質(zhì),耐鹽堿,高感條銹病,品質(zhì)較差。由甘肅省農(nóng)科院生物技術(shù)研究所采用花粉管通道法育成的粉質(zhì)春小麥品種[18]。

1.1.2 儀器

Ther mo Helios可見(jiàn) /紫外分光光度計(jì):UN I CAM公司;PROTEAN II xi電泳儀 (Biorad Mini-Protean Tetra Electrophoresis System):美國(guó) Bio-rad公司;FTI-500型 Fujifilm凝膠成像系統(tǒng):Pharmacia公司;Te2 cator1030全自動(dòng)凱氏定氮儀:瑞典 Tecator公司;GX2 DL-202型蛋白質(zhì) -賴(lài)氨酸分析儀:北京檢測(cè)儀器廠(chǎng);HGT-1000型容重器:上東方衡器廠(chǎng);BAU-A型沉淀值測(cè)定儀:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)儀器廠(chǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 供體總 DNA的提取

采用 CTAB法,按照劉學(xué)春等[19]報(bào)道的方法,提取供體高粱基因組 DNA,紫外分光光度計(jì)檢測(cè),A260/A230=2.13>2.00,A260/A280=1.87>1.80;瓊脂糖電泳呈單一區(qū)帶,無(wú)拖尾現(xiàn)象,表明所提純的 DNA分子質(zhì)量在 50 ku以上,蛋白質(zhì)等雜質(zhì)已去除干凈,達(dá)到作物DNA導(dǎo)入所要求的純度?；蚪M DNA溶于1×SSC溶液,4℃儲(chǔ)存,導(dǎo)入前用蒸餾水稀釋至300μg·mL-1。

1.2.2 供體高粱基因組 DNA的導(dǎo)入及后代的處理與選擇

供體高粱基因組 DNA的花粉管通道法導(dǎo)入?yún)⒖寄呓ǜ５鹊姆椒╗4,18]。待導(dǎo)入穗幼胚形成后,記作D0代種子。取其 15～20 d胚齡的幼胚進(jìn)行幼胚培養(yǎng),于MS培養(yǎng)基上直接誘導(dǎo)幼胚成苗 (D1),并于溫室加代選擇,所獲 D1代種子進(jìn)行田間點(diǎn)播。D2代點(diǎn)播于單株選擇圃,選擇各種變異株,按單株收取種子;自 D3代起播種于株系選擇圃,連續(xù)選擇優(yōu)良株系,直至獲得穩(wěn)定的變異株系和有價(jià)值的育種材料。D4～D6代依次參加高代產(chǎn)量比較試驗(yàn)、品系鑒定試驗(yàn)和品種比較試驗(yàn),逐代篩選優(yōu)良品系。自 D1代起進(jìn)行觀察、記載和統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3 高分子質(zhì)量麥谷蛋白亞基鑒定

參考倪建福等的方法[4]。HMW-GS樣品的制備過(guò)程:單粒種子放入玻璃紙中磨碎后轉(zhuǎn)進(jìn) 1.5 mL離心管中,加入 150μL提取液 (100 mL中含 12.5 mL,0.5 mmol/L的 TrisHCl,pH 6.7,20 mL,10%的SDS,5 mL巰基乙醇,10 mL甘油,10 mL,0.02%的溴酚藍(lán)),玻棒碾磨 3～5 min,沸水中煮 3 min,6 000～7 000 r/min離心 10 min,取上清液加 125μL,70%乙醇沉淀麥谷蛋白,10 000 r/min再離心5 min,收集沉淀。沉淀涼干后用 50μL提取液溶解待用。

SDS-PAGE:采用 SDS連續(xù)緩沖系統(tǒng),分離膠10%(pH 8.9),濃縮膠 3.5%(pH 6.7)。SDSPAGE電泳:電極緩沖液為 0.025 mmol/L TrisCl,0.192 mmol/L甘氨酸,0.001%SDS,pH 8.3。濃縮膠電壓為 200 V,進(jìn)入分離膠后 100 V穩(wěn)壓電泳。染色、脫色和保存:凝膠用 10%三氯乙酸固定后,0.05%,R-250染色 3 h,7.0%冰乙酸溶液脫色至背景清晰。照相、掃描或干膠保存。

1.2.4 品質(zhì)分析

自D6代委托省級(jí)作物品質(zhì)化驗(yàn)分析機(jī)構(gòu) (甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)測(cè)試中心)進(jìn)行新品系的品質(zhì)化驗(yàn)分析。容重測(cè)定:采用稱(chēng)重法 (GB/T5498—1985);粗蛋白含量測(cè)定:采用半微量凱氏定氮法(GB5511—1985);氨基酸含量測(cè)定:采用染料結(jié)合法(GB4801—1984);沉淀值測(cè)定:采用 SDS法 (GB/T15685—1995);濕面筋測(cè)定:采用手工洗滌法 (GB/T14608—1993);淀粉含量測(cè)定:采用采用α-淀粉酶法 (GB/T 9826—1988)。

2 結(jié)果與分析

2.1 高分子質(zhì)量麥谷蛋白亞基鑒定

HMW-GS檢測(cè)結(jié)果顯示:后代新品系 2001502-23含有 7+8、5+10優(yōu)質(zhì)亞基,與導(dǎo)入受體 89122(含有 7+8、2+12亞基 )相比 ,HMW-GS發(fā)生明顯變異,GulD1位基因發(fā)生等位變異,其表達(dá)產(chǎn)物由原來(lái) (89122)的 2+12亞基為 5+10亞基,但高粱種子貯藏蛋白中并沒(méi)有亞基 5+10,從而實(shí)現(xiàn)了麥谷蛋白亞基的改良。這與倪建福等[4]報(bào)道的高粱基因組DNA的導(dǎo)入春小麥甘麥 8號(hào)的后代 89144的 HMWGS基因變異情況相同。這種相同的異源供體基因組DNA導(dǎo)入不同小麥材料產(chǎn)生了相同的變異情況,其可能的原因是異源高粱基因組DNA的導(dǎo)入對(duì)受體基因組中 HMW-GS基因的生物誘變機(jī)理和效果相同所致。

圖 1 外源DNA導(dǎo)入受體與后代新品系的 HMW-GS組成的比較

2.2 籽粒和面粉品質(zhì)分析

外源DNA供體、導(dǎo)入受體與后代新品系的籽粒營(yíng)養(yǎng)及加工品質(zhì)分析結(jié)果顯示,外源 DNA導(dǎo)入新品系 2001502-23的容重、蛋白質(zhì)含量、籽粒粗蛋白含量、賴(lài)氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、濕面筋質(zhì)量分?jǐn)?shù)、沉淀值等較導(dǎo)入受體 89122和DNA供體高粱均出現(xiàn)不同程度的明顯增加 (見(jiàn)表 1)。排除高粱作為雜糧作物本身的品質(zhì)指標(biāo)較低外,導(dǎo)入新品系 2001502-23其較導(dǎo)入受體 89122的粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高 17.56%,容重提高3.80%,賴(lài)氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高 9.11%,濕面筋質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低10.30%,沉淀值降低 11.38%,品質(zhì)類(lèi)型均屬于中筋小麥,導(dǎo)入新品系籽粒綜合品質(zhì)得到明顯改善。將高粱DNA導(dǎo)入受體小麥隴春 13就可獲得了品質(zhì)指標(biāo)得到改良的小麥品系 89122[18]。我國(guó)首批面包小麥品種蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 14.64%～18.61%[20-21],而小麥淀粉特性是決定含小麥淀粉食品食用品質(zhì)的一個(gè)主要因素[22],沉淀值可作為小麥品種選育過(guò)程中預(yù)測(cè)面條筋力的首選指標(biāo)[23-25]。這些研究結(jié)果證明高粱外源基因?qū)胄←溡鹆讼鄳?yīng)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)等籽粒和小麥粉品質(zhì)性狀的變化。

表 1 外源DNA供體、導(dǎo)入受體與后代新品系的籽粒營(yíng)養(yǎng)及加工品質(zhì)的比較與分析

3 討論與結(jié)論

利用花粉管通道法將多種異源基因組 DNA導(dǎo)入小麥,實(shí)現(xiàn)小麥的品質(zhì)、抗性等多方面的遺傳改良已成為小麥生物技術(shù)育種的重要手段之一。

將高粱基因組 DNA導(dǎo)入粉質(zhì)籽粒的穩(wěn)定小麥品系,獲得 1個(gè)穩(wěn)定的遺傳變異優(yōu)良新品種,實(shí)現(xiàn)了受體小麥 HMW-GS基因的遺傳轉(zhuǎn)化和品質(zhì)性狀改良,與王廣金等[26]、倪建福等[4]、劉香利等[27]報(bào)道的結(jié)果相同,這說(shuō)明 HMW-GS基因的轉(zhuǎn)化和遺傳變異具有相當(dāng)?shù)墓残?加之目前 HMW-GS基因定位較清楚,有望成為品質(zhì)遺傳改良中的標(biāo)記基因。

本研究中,異源高粱基因組 DNA導(dǎo)入受體小麥后,后代新品系 HMW-GS發(fā)生明顯變異,Gul D1位點(diǎn)基因發(fā)生等位變異,其表達(dá)產(chǎn)物由原來(lái) (89122)的2+12亞基為 5+10亞基,但高粱種子貯藏蛋白中并沒(méi)有亞基 5+10。該結(jié)果與倪建福等[4]報(bào)道的高粱基因組DNA的導(dǎo)入春小麥甘麥 8號(hào)的后代 89144的HMW-GS基因變異情況相同。這種相同的異源供體基因組 DNA導(dǎo)入不同小麥材料產(chǎn)生了相同的變異情況,其可能的原因是異源高粱基因組 DNA的導(dǎo)入對(duì)受體基因組中 HMW-GS基因的生物誘變機(jī)理和變異效果相同所致。外源基因進(jìn)入受體后會(huì)受到包括選擇在內(nèi)的各種因素的影響,且涉及到結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因相互作用以及插入片段的位置效應(yīng)等。張魯軍等[28]報(bào)道了 HMW-GS基因可能發(fā)生的基因沉默、相關(guān)元件的激活等,包括染色體部分缺失、調(diào)控元件突變以及基因突變等。李三和等[29]報(bào)道,在外源基因的影響下,雜交后代出現(xiàn)了新的、雜交親本并不表達(dá)的高分子質(zhì)量麥谷蛋白亞基,并認(rèn)為這是多拷貝的外源基因在不同于受體環(huán)境的細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)發(fā)生了變化,且由于外源基因的插入引起了內(nèi)源高分子質(zhì)量麥谷蛋白亞基組成的變異。上述研究中異源高粱基因組 DNA導(dǎo)入受體小麥后的新品系高分子質(zhì)量麥谷蛋白亞基的變異機(jī)理也可能與此情況類(lèi)似。

另外,關(guān)于外源 DNA導(dǎo)入引起變異的機(jī)理,提出了各種推測(cè):①外源DNA重組插入具有調(diào)節(jié)基因功能的高度或中度重復(fù)序列,從而改變其調(diào)節(jié)功能,也不排斥外源 DNA重組插入導(dǎo)致單一序列的結(jié)構(gòu)基因失活或突變[30]。②外源 DNA導(dǎo)入前期或整合時(shí)存在被受體切割酶與重組酶適當(dāng)酶切和重組的過(guò)程,從而導(dǎo)致導(dǎo)入后代產(chǎn)生廣泛變異[31]。③外源DNA與受體細(xì)胞中的組蛋白及非組蛋白結(jié)合形成“小染色體”(從而不被酶降解),與受體染色體局部同源,可與受體染色體局部形成“擬聯(lián)會(huì)復(fù)合體”,在受體DNA復(fù)制時(shí),擬聯(lián)會(huì)復(fù)合體中外源DNA和與受體同源DNA片段發(fā)生置換;而不同源的小染色體可能以“B-染色體”形式存在或被消化。④個(gè)別較小的外源DNA斷片有可能在受體 DNA復(fù)制時(shí)直接插入其中[32]。

外源DNA導(dǎo)入后代性狀變異是供體與受體基于DNA分子局部親和性而產(chǎn)生片段雜交的必然結(jié)果。萬(wàn)文舉等[33]報(bào)道外源 DNA導(dǎo)入的雙重作用:直接轉(zhuǎn)化和生物誘變。因此,直接遺傳轉(zhuǎn)化和生物誘變均是外源 DNA導(dǎo)入可能的遺傳轉(zhuǎn)化機(jī)理之一,是一種綜合作用的結(jié)果。這也表明花粉管通道法會(huì)引起很復(fù)雜的受體遺傳特性的變化。而本研究在不同時(shí)間階段和不同受體材料下的研究結(jié)果出現(xiàn)如此相似的結(jié)果,這可能是異源高粱基因組 DNA導(dǎo)入小麥后受體基因組發(fā)生的相同作用和類(lèi)似變異的普遍現(xiàn)象。關(guān)于高粱DNA導(dǎo)入引起小麥 HMW-GS基因突變的確切分子機(jī)理目前正在進(jìn)行當(dāng)中,將另文報(bào)道。

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Introducing Sorghum DNA into SpringWheat:HMW-GS Variation,Quality I mprovement and ItsMechanis ms

Ou Qiaoming1Ni Jianfu1CuiWenjuan1Pang Binshuang2
(Bio-technology Institute,Gansu Academy ofAgricultural Sciences1,Lanzhou 730070)
(HybridWheat Engineering And Technique Research Center,Beijing academy of agriculture and forestry sciences2,Beijing 100089)

The genome DNA of sorghum was introduced into floury grain springwheatNo.89122 via the pollen tube pathway.Excellent variant lineswere chosen with multi-generation selecting.The detection of HMW-GS by SDS-PAGE electrophoresis and quality analysiswere conducted.One stable variantwasobtained.Comparedwith its recipientNo.89122,the new variant 2001502-23 contained quality subunits 7+8 and 5+10,significant variation of HMW-GS occurred,gene alleles appeared in Gul D1Locus,and HMW-GS 5+10 were expressed in variants 2001502-23 while subunits 2+12 were presented in its recipient No.89122. Its quality indexes were i mproved compared with the receptor.Thus the genetic transformation of HMW-GS gene and quality improvement for the re2 ceptorwheatwas realized in this study.This result indicates that the genetic transfor mation of HMW-GS gene and ai m character i mprovement of quality in wheat can be entirely achieved via the pollen tube pathway.In addition,the bio-inducted mutation is one of the mechanisms of its genetic transfor mation.

wheat,sorghum DNA,pollen-tube pathway,HMW-GS,gene alleles

S512.332

A

1003-0174(2011)01-0015-05

甘肅省重大科技專(zhuān)項(xiàng)(0801NKDA015),甘肅省科技支撐計(jì)劃[自然科學(xué)基金 ](0803RJZA041),甘肅省農(nóng)科院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新專(zhuān)項(xiàng)(2009GAAS16)

2010-03-22

歐巧明,男,1976年出生,助理研究員,碩士,小麥生物技術(shù)育種及品質(zhì)改良

倪建福,男,1951年出生,研究員,小麥生物技術(shù)育種