黃紀念 宋國輝 孫 強 詹傳保

(河南省農科院農副產品加工研究所,鄭州 450002)

HPLC 測定芝麻油中木脂素類化合物含量研究

黃紀念 宋國輝 孫 強 詹傳保

(河南省農科院農副產品加工研究所,鄭州 450002)

建立了 HPLC同時測定芝麻油中芝麻素、芝麻林素、芝麻酚和芝麻素酚 4種木脂素化合物含量的方法。首先確定了 HPLC法分離和測定這 4種物質的色譜條件,色譜柱為 ODS-C18(250 mm ×4.6 mm,5μm);檢測波長:芝麻素和芝麻林素為 287 nm,芝麻酚和芝麻素酚為 293 nm;柱溫 30℃;流速 0.8 mL/min,流動相為甲醇 (A)和水 (B)進行梯度洗脫,梯度為 0 min(A,60%)→6 min(A,60%)→9 min(A,75%)→24 min(A,70%)→27 min(A,60%)→32 min(A,60%)。同時比較篩選了皂化法、氧化鋁柱層析法和薄層層析法 3種去除脂肪類成分的前處理方法,確定薄層層析法為最有效的前處理方法。

芝麻素 芝麻林素 芝麻酚 芝麻素酚 高效液相色譜法

芝麻中含有芝麻素、芝麻林素、芝麻酚及芝麻素酚等木脂素類化合物,這些物質的存在大大提高了芝麻油的穩(wěn)定性,同時也是芝麻油具有眾多生物功能活性的物質基礎。其中芝麻素和芝麻林素含量相對較高,芝麻素在在芝麻油中含量為 0.4%～0.8%,芝麻林素在在芝麻油中為 0.2%～0.4%[1]。芝麻種子中一般不含有芝麻酚和芝麻素酚,我國的特色產品“香油”屬于焙炒芝麻油,在焙炒過程中產生芝麻酚和芝麻素酚。它們在焙炒芝麻油中含量很低,不超過 0.01%[2],但其抗氧化活性卻遠遠高于芝麻素和芝麻林素,是焙炒芝麻油的穩(wěn)定性遠遠高于非焙炒芝麻粗油的原因所在 (非焙炒芝麻粗油幾乎不含有芝麻酚和芝麻素酚)。

對芝麻及芝麻油中木脂素類化合物含量的檢測方法主要有分光光度法、薄層色譜法 (TLC)和 HPLC法等[3]。分光光度法干擾大,準確性低,一般用于木脂素總量的測定[4]。薄層色譜法一般用于木酯素類的分離和鑒定,用于定量分析則準確度較低[5]。HPLC法是定量分析芝麻木脂素類化合物的主要方法[6-10],測定結果最為準確。國內對芝麻及芝麻油中抗氧化物質的HPLC法測定主要局限于芝麻素和芝麻林素[6-7],芝麻酚和芝麻素酚由于含量低,特別芝麻素酚缺乏標準對照品,能同時測定芝麻素、芝麻林素、芝麻酚和芝麻素酚這 4種物質的還未見報道。國外對芝麻油中抗氧化物質的 HPLC法測定是采用溶劑溶解油樣直接測定,未經(jīng)過前處理去除脂肪類成分[8-10]。大量的脂肪類成分的存在影響分離的效果,會造成基線漂移厲害,峰形不好,雜峰多及干擾嚴重,影響測定的準確性。而且脂肪類成分與反相色譜填料結合牢固,不易洗脫,會造成柱壓升高,柱效變差,色譜柱損耗嚴重。

因此,建立合理有效的能同時測定芝麻油中這 4種物質的檢測方法,對芝麻中木脂素類物質的深入研究及開發(fā)應用具有重要意義。本研究首先確定了能同時分離芝麻素、芝麻林素、芝麻酚及芝麻素酚 4種成分的儀器色譜條件,然后對比篩選了皂化法、氧化鋁柱層析法和薄層層析法這 3種前處理去除油脂的方法,確定了去除脂肪類物質效果最好的前處理方法,從而建立完整的 HPLC測定方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Ulti mate3000高效液相色譜儀:美國戴安公司;XBPODS-C18色譜柱 (25 mm ×4.6 mm,5μm);XBPC18保護柱;PDA-3000二極管陣列檢測器。

芝麻素標準品 (純度 98%):中國藥品生物制品檢定所;芝麻酚標準品 (純度 98%):Alfa Aesar公司;芝麻林素及芝麻素酚標準品,試驗室自制,I R,MS,NMR對其進行了確證,HPLC檢測純度分別為97.08%和97.46%;芝麻油:市售小磨香油 (產自鄭州);甲醇:色譜純,美國迪馬公司;超純水由艾柯超純水機制。

1.2 色譜條件

色譜柱:XBPODS-C18色譜柱 (25 mm ×4.6 mm,5μm);檢測波長:芝麻素和芝麻林素為 287 nm,芝麻酚和芝麻素酚為 293 nm;柱溫:30℃;流速:0.8 mL/min;洗脫劑及洗脫梯度見表 1。

表 1 HPLC洗脫梯度

1.3 標準溶液的配制

稱取 5 mg芝麻酚、5 mg芝麻素酚、10 mg芝麻素和 6 mg芝麻林素分別加入丙酮溶解并定容至 50 mL,配成芝麻酚質量濃度為 50μg/mL、芝麻素酚質量濃度為 50μg/mL、芝麻素質量濃度為 200μg/mL和芝麻林素質量濃度為 120μg/mL的標準液。

1.4 樣品的制備

1.4.1 皂化法

按照文獻[7]的方法并加以改進。

取 1 g芝麻油加入 15 mL乙醇溶解于 100 mL燒瓶中,加 1∶1的氫氧化鉀溶液 8 mL,將燒瓶放在磁力攪拌器上,80℃水浴下反應 30 min,冷卻。

芝麻素與芝麻林素的萃取:將皂化物移入分液漏斗中,加入乙酸乙酯萃取 3次,其中每次 30 mL,合并乙酸乙酯萃取液,水洗至中性,減壓蒸干乙酸乙酯,得萃取物樣品一備用。

芝麻酚與芝麻素酚的萃取:將收集的水層中加入15%H2SO4溶液調節(jié)至 pH 3,用二氯甲烷萃取 3次,每次 30 mL。合并二氯甲烷萃取液并用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌至弱堿性,再用蒸餾水洗至中性。無水硫酸鈉干燥,減壓蒸除溶劑。得萃取物樣品二備用。

將萃取物兩份樣品用丙酮溶解后合并,丙酮定容至 25 mL,作為 HPLC檢測樣品,進樣量 10μL。

1.4.2 氧化鋁柱層析法

按照文獻[6]的方法,并加以改進。

層析柱的制備:190℃下活化層析用氧化鋁,采用濕法裝柱 (先向柱中加入一定量的石油醚,再把氧化鋁用洗脫液浸泡加入,完成后用洗脫液走兩遍平衡柱子)。稱取 5 g芝麻油用石油醚溶解后上樣。接下來先用 100 mL石油醚洗脫,再用 150 mL乙酸乙酯洗脫,收集乙酸乙酯洗脫組分。

乙酸乙酯洗脫組分減壓蒸干溶劑后加人丙酮溶解,定容至 25 mL,作為 HPLC檢測樣品,進行含量測定,進樣量 10μL。

1.4.3 薄層層析法

稱取 0.1 g的芝麻油樣品用丙酮溶解,上樣。然后將層析板放入層析缸中展開,展開劑為石油醚 ∶乙酸乙酯 =20∶1。展開結束后,揮干溶劑,在 254 nm下畫出木脂素類條帶并刮下,用 30 mL乙酸乙酯浸提,超聲輔助,過濾,洗滌。將濾液減壓蒸干后加人丙酮溶解,定容至 25 mL,作為 HPLC檢測樣品,進行含量測定。

2 結果與討論

2.1 檢測波長的確定

1.3 中配制的芝麻素、芝麻林素、芝麻酚和芝麻素酚的標準溶液分別進樣 5μL,以甲醇 ∶水 =70∶30為流動相,在 230～380 nm內進行光譜掃描,以確定各化合物的最大吸收波長,從而確定合適的檢測波長。光譜掃描結果顯示芝麻素、芝麻林素、芝麻酚和芝麻素酚在試驗條件下的最大波長分別為 286、288、294和 292 nm。綜合考慮最終選擇了 287 nm作為芝麻素和芝麻林素的檢測波長,293 nm作為芝麻酚和芝麻素酚的檢測波長。

2.2 色譜條件選擇

由于芝麻酚和芝麻素酚含有酚羥基,其極性相對較強,而芝麻素和芝麻林素不含酚羥基,極性相對較弱,用 C18反相色譜柱分離時芝麻酚和芝麻素酚的保留時間較短,芝麻素和芝麻林素的保留時間相對較長,若要使 4種物質能夠有效分離且保留時間相對較短,需要采用梯度洗脫的方法。HPLC法分離木脂素類化合物一般用甲醇和水作為洗脫劑,為找出最佳的色譜條件,將水的比例在 60%～20%范圍內調整,最終確定了表 1所示的洗脫梯度。結合檢測波長,確定了 1.2中的色譜條件。以確定的色譜條件對芝麻素、芝麻林素、芝麻酚及芝麻素酚的標準溶液和小磨香油經(jīng) 1.4.3方法處理后樣品進行 HPLC測定,其色譜圖如圖 1所示,結果顯示該色譜條件對目標化合物的分離效果良好,尤其是芝麻素酚的兩種異構體也得到分離。

圖 1 標樣及典型樣品的 HPLC測定色譜圖

2.3 精密度測定

取一樣品溶液連續(xù)進樣 5次,每次 10μL,計算各物質峰面積的 RSD,所得 RSD結果為芝麻酚0.49%、芝麻素酚 0.36%、芝麻素 0.11%和芝麻林素0.37%。各成分 RSD均小于 1%,精密度良好。

2.4 樣品的穩(wěn)定性測定

取一個樣品溶液每 2 h測定一次,計算各物質峰面積隨放置時間延長的變化情況,結果在 10 h內,各物質峰面積的 RSD值分別為:芝麻酚 0.68%、芝麻素酚 0.54%、芝麻素 0.41%、芝麻林素 0.51%,結果表明樣品溶液中芝麻酚、芝麻素酚、芝麻素和芝麻林素在 10 h內保持穩(wěn)定。

2.5 標準曲線的建立

將 1.3中配制的標準品溶液分別以 0.2、0.3、0.5、0.8、1、1.5、2.5、3、3.5、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15μL的進樣量進樣,以 1.2的色譜條件測定,以峰面積 (mAU ×min)為橫坐標,含量 (μg)為縱坐標,建立標準曲線,擬合回歸方程。各物質的回歸方程及檢測限見表 2。

表 2 四種物質 HPLC測定的擬合回歸方程

2.6 3種預處理方法比較

取已知木脂素含量的芝麻油樣品溶液,分 3份,每份分為 3個樣,共 9個樣,分別向每份樣品溶液中加入芝麻酚、芝麻素酚、芝麻素和芝麻林素標準品,分別采用 1.4中所述的 3種方法處理,并用 HPLC測定其含量,按回收率 =(實測值 -樣品所含被測組分)/加入的樣品量 ×100%計算各物質的加樣回收率。加樣回收率及 RSD%結果見表 3。

表 3 3種方法處理后 4種物質的加樣回收率及 RSD%

從表 3可以看出,對于芝麻素和芝麻林素來說,3種方法回收率都在 (100±5)%的合理范圍內,RSD值也符合要求。對于芝麻酚和芝麻素酚來說,皂化法和氧化鋁柱層析法的回收率都小于 95%,準確性不符合要求,制備薄層層析法的回收率在 98%以上,具有較高的準確性。綜合來說,若只檢測芝麻素和芝麻林素,3種前處理方法都有效,若同時檢測這 4種化合物,則只有制備薄層層析法能達到理想效果。

皂化法和氧化鋁柱層析法對芝麻酚和芝麻素酚的回收率較差,這可能與萃取皂化法操作步驟多,耗時長,特別是對芝麻酚和芝麻素酚的萃取所經(jīng)步驟更多,這可能導致了芝麻酚和芝麻素酚的回收率較差。采用氧化鋁柱層析時芝麻酚和芝麻素酚的回收率較差,可能與氧化鋁對具有弱酸性物質的吸附能力強有關。

從處理方法本身來說,皂化法操作繁瑣,耗量大,耗時長,效率低。氧化鋁柱層析法影響因素較多,柱子的裝填水平均一性差,對分離過程會有較大的影響,而且耗費的溶劑量大。相比較而言,薄層層析法操作相對簡單,消耗溶劑少,各步驟操作一致性好。

3 結論

通過對分離這 4種化合物的色譜分離條件的研究和前處理方法的篩選,建立了 HPLC同時測定芝麻油中這 4種物質的 HPLC測定方法。即采用制備性薄層層析法作為預處理脫除脂肪類成分的方法,方法本身操作簡單,一致性好。采用試驗中的儀器色譜條件,能對這 4種物質有效分離,并采用外標法建立了各物質的標準曲線。方法一致性強,穩(wěn)定性、準確性可靠。

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Deter mination ofLignans in Sesame Oil by HPLC

Huang Jinian Song Guohui Sun Qiang Zhan Chuanbao
(Institute ofAgricultural Products Processing,Henan Academy ofAgriculture Sciences,Zhengzhou 450002)

A HPLC method for simultaneously determining contents of lignans,including sesamin,sesamolin,sesamol and sesaminol,in sesame oil has been developed.Separation and content determination of the four lignans were achieved by usingODS-C18column(250 mm ×4.6 mm,5μm)and by a gradient elution using(A)metha2 nol and(B)water as the mobile phase of 0 min(A,60%)→6 min(A,60%)→9 min(A,75%)→24 min(A,70%)→27 min(A,60%)→32 min(A,60%).The flow rate was 0.8 mL/min and column temperature was 30℃.The wavelength was 287 nm for sesamin and sesamolin,and 293 nm for sesamol and sesaminol.Three pretreat2 mentmethods have been compared for the removal of triglyceride from sesame oil,namely saponification,alumina col2 umn chromatography and thin layer chromatography,and results showed that thin layer chromatographywas the best.

sesamin,sesamolin,sesamol,sesaminol,HPLC

TS207.3

A

1003-0174(2011)01-0120-04

河南省杰出青年科學基金(0612001500)

2010-02-09

黃紀念,1971年出生,男,研究員,博士,農產品精深加工與功能食品開發(fā)