羅艷婷， 劉金來△ ， 陳 飛， 譚 文

(1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 廣州 510630；2凱法生物醫(yī)藥有限公司，廣東 東莞 523808；3華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006)

曲美他嗪對心肌梗死大鼠短期心肌保護(hù)作用的研究*

羅艷婷1， 劉金來1△， 陳 飛2， 譚 文3

(1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 廣州 510630；2凱法生物醫(yī)藥有限公司，廣東 東莞 523808；3華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006)

目的探討曲美他嗪對大鼠心肌梗死心臟的保護(hù)作用及其部分作用機(jī)制。方法90只SPF級SD大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(n=30)、心肌梗死組(n=30)和曲美他嗪治療組(n=30)。心肌梗死組和曲美他嗪治療組在高位結(jié)扎左冠狀動脈前降支，制成心肌梗死模型。假手術(shù)組及心肌梗死組在術(shù)前灌胃給予生理鹽水，曲美他嗪組灌胃給予曲美他嗪(3 mg/kg，每天2次)，連續(xù)治療1周、2周和4周。冠脈結(jié)扎后8 h、24 h和48 h檢測血清心肌肌鈣蛋白I濃度。在治療后1周、2周和4周后測量平均動脈壓、心率、收縮期心室壓力最大上升速率(+dp/dtmax)及舒張期左室壓力最大下降速率(-dp/dtmax)，并檢測心肌梗死面積，TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)。結(jié)果在連續(xù)給藥2周及4周后曲美他嗪組與心肌梗死組相比，能顯著改善大鼠的心臟收縮功能[第2周：+dp/dtmax(8 101±990)mmHg/svs(5 868±1 302)mmHg/s; 第4周：+dp/dtmax(7 629±1 181) mmHg/svs(5 620±454) mmHg/s]及舒張功能[第2周：-dp/dtmax(6 514±1 558) mmHg/svs(4 750±1 463) mmHg/s；第4周：(5 883±1 379) mmHg/svs(4 256±731) mmHg/s](均Plt;0.01)，不影響心率及平均動脈壓(Pgt;0.05); 曲美他嗪可降低大鼠心肌梗死后24 h血清心肌肌鈣蛋白I水平(Plt;0.01)，減少大鼠心肌梗死面積(Plt;0.01)，并抑制心肌缺血損傷區(qū)的心肌細(xì)胞凋亡(Plt;0.01)。結(jié)論曲美他嗪對心肌梗死后大鼠具有明確的心臟保護(hù)作用，抑制心肌梗死后缺血損傷區(qū)細(xì)胞凋亡是其心肌保護(hù)作用的機(jī)制之一。

曲美他嗪； 心肌梗死； 細(xì)胞凋亡； 大鼠

曲美他嗪作為一種哌嗪類的新型代謝類細(xì)胞保護(hù)劑，已被證實(shí)對慢性穩(wěn)定性心絞痛治療有效[1]，并在急性心肌梗死中有較好的保護(hù)作用[2]。然而曲美他嗪在心肌梗死亞急性期的治療效果及其對血流動力學(xué)的影響仍未明確。本實(shí)驗(yàn)在大鼠心肌梗死模型中短期給予曲美他嗪治療，觀察其對心肌梗死大鼠血流動力學(xué)、心肌梗死面積的影響，并初步探討曲美他嗪對心肌梗死模型中缺血區(qū)及損傷區(qū)細(xì)胞凋亡的影響。

材 料 和 方 法

1材料

SPF級SD大鼠90只，雌雄各半[由廣東省動物實(shí)驗(yàn)中心提供，體重180～350 g，批號SCK (粵) 2008 -0002]；鹽酸曲美他嗪(施維雅制藥有限公司，批號9A3560)；伊紅(Amersco)；Triton X-100(Amersco，批號9002-93-1)。凱基TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒(南京凱基生物公司，批號KGA7032)。ML870 PowerLab 8/30生理記錄儀(ADInstruments)、MLT844壓力傳感器(ADInstruments)、Millar導(dǎo)管(型號SPR-52A，3.5F，Millar Instruments)；肢體Ⅱ?qū)?lián)(MLA1230, 1.5 mm，ADInstruments)；TKR-200C呼吸機(jī)(江西省特力麻醉呼吸設(shè)備有限公司)；Olympus CX31顯微鏡(Olympus)；ADVIR Centaur CP全自動化學(xué)發(fā)光分析儀(西門子公司)；Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)(Media Cybernetics)。

2方法

2.1動物分組及給藥方式 90只SPF級SD大鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham,S組) (n=30)、心肌梗死組(myocardial infarction,MI組) (n=30)和心肌梗死曲美他嗪治療組(MI+trimetazidine,MT組) (n=30)。假手術(shù)組只穿線、不結(jié)扎；心肌梗死組及曲美他嗪治療組造心肌梗死模型，其中心肌梗死組在結(jié)扎前10 min，結(jié)扎后每天2次灌胃給予生理鹽水，按2 mL/kg給予；曲美他嗪治療組，在結(jié)扎前1 h及結(jié)扎后每天2次灌胃給藥(曲美他嗪3 mg/kg)。在手術(shù)后8 h、24 h及48 h檢測血清心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin,cTnI)濃度；各組在連續(xù)給藥1周(n=10)、2周(n=10)及4周(n=10)后，測量大鼠心室內(nèi)壓、心率、平均動脈壓和心電圖，處死動物后測定心肌梗死面積、心肌細(xì)胞凋亡等指標(biāo)。

2.2模型制備 3%戊巴比妥鈉溶液1.5 mL/kg腹腔注射麻醉，固定大鼠四肢、頭部。連接心電圖導(dǎo)聯(lián)，分別為右上肢、左下肢、腹部(肢體Ⅱ?qū)?lián))。經(jīng)口氣管插管，使用麻醉喉鏡暴露大鼠喉部，并插入大小合適的氣管插管，接小動物呼吸機(jī)，設(shè)潮氣量20～30 mL/kg，頻率60 min。開胸、結(jié)扎冠脈：胸部去毛，碘伏消毒、鋪巾，沿4、5肋間作斜切口，暴露心臟，剝脫心包，暴露左心耳與肺動脈圓錐間的靜脈(冠脈主干在此與靜脈伴行)，以此靜脈為標(biāo)記進(jìn)行結(jié)扎，用5/0帶線縫合針在左心耳下3～5 mm、靜脈周圍1.5～2 mm左冠狀動脈處縫1針，結(jié)扎絲線(假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎)。關(guān)胸、抽吸腔內(nèi)氣體保持負(fù)壓、逐層縫合。冠脈結(jié)扎成功標(biāo)志：結(jié)扎5 min后ST段弓背抬高或病理性Q波形成；R波振幅減低；結(jié)扎區(qū)心肌紫紺。

2.3左心室內(nèi)壓、心率及動脈壓測量 左心室內(nèi)插管：Millar導(dǎo)管定標(biāo)。行頸正中切口約3 cm，鈍性分離皮下組織和頸前正中肌肉，分離右側(cè)頸總動脈，穿線(分離動脈時盡量避免牽拉迷走神經(jīng))，結(jié)扎右頸總動脈遠(yuǎn)心端，并在近心端置小動脈夾，穿線備用。在近心端結(jié)扎處呈45°剪一“V”型小口，插入Millar導(dǎo)管后松開動脈夾，當(dāng)出現(xiàn)典型心室內(nèi)壓波形，扎緊近心端。Millar導(dǎo)管記錄收縮期左心室壓力最大上升速率(the maximum rising rate of left ventricle systolic pressure,+dp/dtmax)、舒張期左心室壓力最大下降速率(the maximum descending rate of left ventricle diastolic pressure,-dp/dtmax)及心率(heart rate，HR)。

右側(cè)股動脈插管：壓力換能器定標(biāo)。切開右側(cè)股部皮膚，分離股動脈，穿線、結(jié)扎遠(yuǎn)心端，方法同上。當(dāng)導(dǎo)管插入動脈后，出現(xiàn)穩(wěn)定的動脈波形后，扎緊近心端。記錄平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)。

2.4血清cTnI測定 通過剪尾取血法在結(jié)扎冠脈前、結(jié)扎冠脈后8 h、24 h及48 h取血約1 mL置于干燥管中，在室溫下靜置30 min后，以3 000 r/min的速度離心20 min，取上清液，做好標(biāo)記，存放在-80 ℃超低溫冰箱中保存，統(tǒng)一檢測。檢測時將低溫保存的大鼠血清復(fù)溫，用振蕩儀振蕩1 min，為令血清中的測量值在儀器的測量范圍內(nèi)(0～50 μg/L)，需將血清稀釋5倍。取血清80 μL及生理鹽水320 μL充分混合(稀釋5倍)，避免液面中有氣泡形成。樣品檢測：將樣品置入全自動化學(xué)發(fā)光分析儀中，可自動檢測血清中cTnI。

2.5心肌梗死面積測量 取結(jié)扎部位以下5～6 mm心肌組織常規(guī)石蠟包埋切片，并進(jìn)行HE染色。數(shù)碼相機(jī)拍攝左心室橫截面切片，使用Image Pro-Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測量各弧長、周長、面積厚度，按照公式計算梗死面積[3]，以瘢痕弧長百分?jǐn)?shù) (%)=瘢痕弧長/[(外周長+內(nèi)周長)/2]×100%。

2.6心肌細(xì)胞凋亡檢測 采用TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡。取結(jié)扎部位以下5～6 mm心肌組織常規(guī)石蠟包埋切片。切片常規(guī)脫蠟至水，加入蛋白酶K工作液，室溫反應(yīng)15～30 min(根據(jù)組織情況調(diào)整反應(yīng)時間)，PBS液漂洗5 min×2次，浸入封閉液(3%H2O2溶液甲醇)室溫15～25 ℃封閉10 min，PBS液漂洗5 min×2次后進(jìn)入標(biāo)記反應(yīng)。預(yù)處理好的樣本PBS液漂洗5 min×2次，樣本周圍用吸水紙吸干，每個樣本滴加50 μL TdT酶反應(yīng)液，加蓋玻片37 ℃避光濕潤反應(yīng)60 min；PBS液漂洗5 min×3次，樣本周圍用吸水紙吸干，滴加50 μL Strepravidin-HRP工作液，加蓋玻片37 ℃避光濕潤反應(yīng)30 min，PBS液漂洗5 min×3次，0.2%Triton X-100/PBS室溫反應(yīng)5 min；PBS液漂洗5 min×2次，滴加50 μL DAB工作液，室溫顯色反應(yīng)10 min，PBS液漂洗5 min×3次，蘇木素復(fù)染，脫水、透明封片。顯微鏡下觀察、拍照。陽性細(xì)胞顯示為棕黃色。細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptotic index)的計算方法為，每張切片數(shù)5個以上的高倍視野，不少于100個細(xì)胞，分別計數(shù)心肌凋亡細(xì)胞數(shù)，以凋亡細(xì)胞占所計數(shù)細(xì)胞的百分比作為它們各自細(xì)胞凋亡率。

3統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1曲美他嗪對心肌梗死大鼠血流動力學(xué)的影響

在心肌梗死后1周、2周及4周時，曲美他嗪組及心肌梗死組大鼠的心肌收縮功能(+dp/dtmax)及舒張功能(-dp/dtmax)均較假手術(shù)組有顯著下降。在連續(xù)治療1周時，曲美他嗪組的+dp/dtmax、-dp/dtmax與心肌梗死組間+dp/dtmax、-dp/dtmax相比無顯著差異(Pgt;0.05)。在心肌梗死治療2周后，曲美他嗪組與心肌梗死組相比均能顯著增加+dp/dtmax(Plt;0.01)，并能夠顯著增加-dp/dtmax(Plt;0.01)。在心肌梗死治療4周后，曲美他嗪組與心肌梗死組相比均能顯著增加+dp/dtmax(Plt;0.01)及-dp/dtmax(Plt;0.01)。曲美他嗪在改善心肌梗死大鼠心功能的同時，對其心率及平均動脈壓并無顯著影響 (Pgt;0.05)，見表1。

表1 曲美他嗪治療1、2和4周后血流動力學(xué)改變

2曲美他嗪對血清cTnI的影響

假手術(shù)組大鼠在手術(shù)后24 h，血清cTnI并無顯著升高，而其它2組造模后24 h與假手術(shù)組相比，血清cTnI顯著升高(Plt;0.01)。在冠脈結(jié)扎后8 h，與心肌梗死組比較，曲美他嗪組血清cTnI升高程度無顯著差異(Pgt;0.05)。在冠脈結(jié)扎后24 h，曲美他嗪組血清cTnI濃度較冠脈結(jié)扎后8 h有所下降，而心肌梗死組與結(jié)扎后8 h相比仍有繼續(xù)升高。結(jié)扎后24 h，與心肌梗死組比較，曲美他嗪組血清cTnI濃度顯著降低(Plt;0.01)。在結(jié)扎后48 h，曲美他嗪組血清cTnI水平與心肌梗死組比較，無顯著差異(Pgt;0.05)，見圖1。

Figure 1. Comparison of serum cTnI the in three groups at 8 h, 24 h and 48 h±s.n=8.**Plt; 0.01 vs MI group.

3曲美他嗪對心肌梗死面積的影響

HE染色見正常心肌呈紫紅色，梗死心肌呈藍(lán)色，被彈性纖維組織替代，心肌變薄，見圖1。以瘢痕弧長的百分比表示心肌梗死面積，與心肌梗死組比較，曲美他嗪治療組能顯著減少心肌梗死面積(Plt;0.01)，見圖2。

Figure 2. The myocardial infarction area in the three groups. A: HE staining of myocardium(×4); B: comparison of myocardial infarction area in the three groups±s.n=6.**Plt; 0.01 vs MI group.

4曲美他嗪對心肌細(xì)胞凋亡的影響

心肌梗死組的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)較曲美他嗪組顯著增加(Plt;0.01)。心肌梗死組與曲美他嗪組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為(7.930%±0.006%)和(1.500%±0.004%)，見圖3。圖3顯示染成深棕黃色細(xì)胞為凋亡細(xì)胞，主要分布在損傷區(qū)及缺血區(qū)域。心肌梗死組的凋亡細(xì)胞較曲美他嗪組顯著增多，而曲美他嗪組僅在心肌梗死周邊區(qū)域偶見散在的少量心肌梗死細(xì)胞。

Figure 3. Myocardial apoptosis of the three groups. A: the apoptotic cardiomyocytes detected by TUNEL assay (TUNEL staining, ×400);B:apoptotic index of cardiomyocytes in the three groups±s.n=3.**Plt; 0.01 vs MI group.

討 論

心肌梗死早期，因壞死心肌及缺血頓抑心肌收縮功能缺失，常導(dǎo)致心臟收縮功能下降。心肌梗死后出現(xiàn)心肌能量缺乏、鈣超載、自由基生成增多、酸中毒引起的心肌缺血損傷是病情持續(xù)加重的主要原因。Kantor等[4]研究發(fā)現(xiàn)，曲美他嗪的主要作用機(jī)制是通過選擇性抑制線粒體長鏈3-酮脂酰輔酶A硫解酶來抑制長鏈脂肪酸氧化，此過程并不影響三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化。通過抑制耗氧多的游離脂肪酸氧化，轉(zhuǎn)向葡萄糖氧化，利用有限的氧產(chǎn)生更多的ATP，增加心臟收縮功能。此外，曲美他嗪還可保護(hù)線粒體功能，通過減輕細(xì)胞內(nèi)酸中毒、鈣超載、清除氧自由基和抗氧化作用，抑制中性粒細(xì)胞聚集，來減小心肌梗死的面積[5]。一些學(xué)者認(rèn)為，曲美他嗪可與線粒體膜上的可通透性蛋白結(jié)合并使之失活，抑制缺氧時Ca2+內(nèi)流所引起的線粒體腫脹，以增強(qiáng)線粒體抗缺血能力[6]。曲美他嗪對心肌缺血具有明顯的治療作用，與硝酸酯類、β受體阻滯劑及鈣離子拮抗劑不同，在抗心肌缺血時，并不影響血流動力學(xué)參數(shù)和心肌耗氧量[4,7]。本實(shí)驗(yàn)在大鼠心肌梗死模型中，證實(shí)了給予曲美他嗪1-4周治療，可改善心肌梗死大鼠急性期及亞急性期心臟的收縮功能及舒張功能，且不影響其心率及平均動脈壓，并可減少心肌梗死面積，從而證實(shí)了曲美他嗪在心肌梗死的急性期及亞急性期有明確的心臟保護(hù)作用。

細(xì)胞凋亡(apoptosis)是指機(jī)體細(xì)胞在發(fā)育過程中或在某些因素作用下，通過細(xì)胞內(nèi)基因及其產(chǎn)物的調(diào)控而發(fā)生的一種程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death)。Kajstura等[8]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在心肌梗死2 h，大量的心肌細(xì)胞凋亡開始出現(xiàn)，4-5 h后細(xì)胞凋亡仍然是細(xì)胞損害的主要形式，而細(xì)胞壞死緊接其后，1 d時達(dá)高峰，而Palojoki等[9]研究亦證實(shí)，心肌梗死24 h，梗死區(qū)和梗死周邊的心肌細(xì)胞凋亡升高，4周后逐漸下降并伴有非梗死區(qū)細(xì)胞凋亡出現(xiàn)。由此可見，細(xì)胞凋亡為心肌梗死進(jìn)展的重要因素之一。本實(shí)驗(yàn)中初步發(fā)現(xiàn)曲美他嗪可以減少心肌缺血區(qū)域及損傷區(qū)域的心肌細(xì)胞凋亡，說明抑制細(xì)胞凋亡可能是曲美他嗪保護(hù)缺血心肌的重要機(jī)制之一。

總之，本研究表明曲美他嗪具有明確的抗心肌缺血、改善心肌梗死后心功能的作用，并能夠抑制心肌梗死后缺血區(qū)及損傷區(qū)的細(xì)胞凋亡，減少心肌梗死面積。這有助于心肌梗死后心室重構(gòu)的防治及促進(jìn)心功能的恢復(fù)。

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Short-termcardioprotectiveeffectsoftrimetazidineonacutemyocardialinfarctioninrats

LUO Yan-ting1, LIU Jin-lai1, CHEN Fei2, TAN Wen3

(1DepartmentofCardiology,TheThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China;2Key-PharmaBiomedicalCompany,Dongguan523808,China；3SchoolofBioscienceandBioengineering,SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou510006,China.E-mail:lj.lai@medmail.com.cn)

AIM: To observe the myocardial protective effects of trimetazidine on myocardial infarction (MI) in Sprague-Dawley (SD) rats.METHODSNinety SD rats were randomly assigned to 3 groups (n=30 each): myocardial infarction group (MI group), MI+trimetazidine group (MT group) and sham group (S group). By permanently ligating the left anterior descending artery, the MI model was set up in the rats in MI group and MT group. Before and after setting up the MI model, normal saline was given to the rats in MI and S group by gavage. On the other hand, trimetazidine (3 mg/kg,twice per day) was given to the rats in MT group by gavage. At 8 h, 24 h and 48 h after applying trimetazidine, the serum level of cardiac troponin I (cTnI) was measured. At the 1st week, 2nd week and 4th week after treated with trimetazidine, the size of myocardial infarction, the maximum rising rate of the left ventricular systolic pressure (+dp/dtmax) and the maximum descending rate of the left ventricular diastolic pressure (-dp/dtmax) were measured. Also at the 1st week after applying trimetazidine, the cardiomyocyte apoptotic index was detected.RESULTSCompared with MI group 2 weeks after applying trimetazidine, +dp/dtmaxsignificantly increased in MT group [(8 101±990) mmHg/svs(5 868±1 302) mmHg/s,Plt;0.01], and -dp/dtmaxalso significantly increased in MT group [(6 514±1 558) mmHg/svs(4 750±1 463) mmHg/s,Plt;0.01]. Four weeks after applying trimetazidine, +dp/dtmaxsignificantly increased in MT group [(7 629±1 181) mmHg/svs(5 620±454) mmHg/s,Plt;0.01], and -dp/dtmaxalso significantly increased in MT group [(5 883±1 379) mmHg/svs(4 256±731) mmHg/s,Plt;0.01]. At 8 h and 48 h after applying trimetazidine, no statistically significant difference (Pgt;0.05) of serum cTnI between MI group and MT group was observed. However, at 24 h after applying trimetazidine, the serum level of cTnI decreased in MT group [(22.7±14.9) μg/L] as compared with MI group [(42.3±16.2) μg/L,Plt;0.01]. Aditionally, trimetazidine significantly decreased the infarction size of myocardium in MT group (0.248±0.052) as compared with MI group (0.362±0.082,Plt;0.01).CONCLUSIONTrimetazidine has short-term cardioprotective effects on the rats with acute MI by improving myocardial systolic and diastolic functions, reducing infarct size and inhibiting apoptosis.

Trimetazidine; Myocardial infarction; Apoptosis; Rats

1000-4718(2011)11-2072-05

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.11.005

2011-05-23

2011-09-16

廣東省自然科學(xué)基金資助項目(No.07001556[11B])

△通訊作者 Tel：020-85252168；E-mail：lj.lai@medmail.com.cn