潘永勤， 李 菁， 朱偉杰， 賀惠娟

(暨南大學1醫(yī)學院病理生理學系，2生命科學技術學院生殖免疫研究所，廣東 廣州 510632)

絲瓜提取物抗氧化活性的研究*

潘永勤1#， 李 菁1△， 朱偉杰2， 賀惠娟1#

(暨南大學1醫(yī)學院病理生理學系，2生命科學技術學院生殖免疫研究所，廣東 廣州 510632)

目的分離提取絲瓜抗氧化活性成分，觀察其抗氧化效應。方法應用溶劑萃取法及葡聚糖凝膠柱層析法分離提取絲瓜抗氧化活性物質，通過測定不同提取物的抗氧化能力，篩選出絲瓜的抗氧化活性成分。結果由溶劑萃取法獲得絲瓜提取物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，其中提取物Ⅲ抑制DPPH·和OH·自由基效果顯著。提取物Ⅲ經柱層析進一步分離，得到A、B、C、D、E 5種組分，其中組分D、E抑制DPPH·和OH·自由基效果最顯著，經鑒定提取物符合黃酮類物質特性。結論絲瓜具有清除自由基的作用，且主要作用物質為黃酮類物質。

絲瓜； 抗氧化； 黃酮類； 自由基

動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是心腦血管疾病的病理基礎。人體及動物實驗均顯示應用降血脂、抗氧化藥物或食物補充劑可降低LDL水平、減輕LDL氧化修飾，從而延緩AS的發(fā)展[1-3]。

絲瓜(Luffacylindrica,LC)作為食用蔬菜在我國廣泛種植，并以絲瓜絡的形式應用于中藥方劑中，具有清熱解毒之功效?，F(xiàn)代藥理學研究顯示絲瓜具有抗真菌、抗艾滋病病毒、免疫調節(jié)等作用[4-6]。本課題組的前期工作揭示，絲瓜絡具有降血脂及減輕心肌缺血性損傷的作用，新鮮絲瓜亦有降血脂及抗氧化功效[7-10]，但具體的作用機制尚未清楚，絲瓜所含的抗氧化活性物質很可能是其作用基礎。本項工作應用溶劑萃取法和葡聚糖凝膠柱層析法分離提取絲瓜抗氧化活性成分，為絲瓜作為抗AS藥物開發(fā)應用提供參考資料。

材 料 和 方 法

1試劑

1,1-二苯基-2-苦基苯肼(1,1-diphenyl-2-picryl-hydarzyl, DPPH·)購自Sigma；維生素C (vitamine C，Vit C)購自北京普博欣公司；OH·測定試劑盒購自上海榮盛生物技術有限公司。

2絲瓜活性成分的提取

新鮮絲瓜50 g，攪碎，用70%丙酮400 mL浸泡、攪拌4 h。超聲提取30 min，10 000×g離心10 min，收集上清。殘渣再以70%丙酮超聲提取30 min，重復2遍。合并上清液，減壓濃縮后用100 mL雙蒸水溶解得絲瓜初提液Ι。將初提液依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各萃取相減壓濃縮，得石油醚相提取物Ⅱ，乙酸乙酯相提取物Ⅲ，正丁醇相提取物Ⅳ，水相提取物Ⅴ。

Sephadex LH-20 柱層析：0.6 g乙酸乙酯相提取物Ⅲ上樣，甲醇洗脫(0.5 mL/min)，每10 mL為一餾分，共收集30餾分。每一餾份取5 μL, 點樣于薄層硅膠預制板上，以氯仿-甲醇(9∶1)為展開劑，展開。晾干，碘顯色，根據(jù)薄層色譜法(thin-layer chromatography，TLC)將洗脫餾份分為A、B、C、D、E 5個組份。

3DPPH自由基抑制作用的測定

DPPH·為穩(wěn)定的自由基，在517 nm處有最大吸收。當有供氫能力的抗氧化劑存在時，DPPH·的單電子被配對而使其溶液顏色變淺，吸光度值變小，以吸光度的變化反映抗氧化劑活性[12]。提取物對DPPH·的抑制作用按文獻所述方法進行[13]。

4羥自由基(OH·)抑制作用的測定

利用Fenton反應產生羥自由基的原理進行測定，規(guī)定每毫升樣品液在37 ℃下反應1 min，使反應體系中H2O2濃度降低1mmol/L為1個抑制羥自由基能力單位,測定步驟按試劑盒說明進行[14]。

5提取物的鑒定

利用1%三氯化鋁顯色反應對絲瓜提取物進行初步鑒定[15]。

6統(tǒng)計學處理

結 果

1絲瓜提取物對DPPH·的抑制作用

絲瓜提取物Ι、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ均對DPPH·有一定的抑制作用，其中提取物Ⅲ作用效果最顯著。當Ⅲ濃度為1 g/L時，抑制率達100%，且在濃度范圍0.25～1g/L內呈量效關系，見表1。

表1 絲瓜提取物抑制DPPH·能力的比較

2絲瓜提取物對OH·的清除作用

圖1 為絲瓜提取物抑制OH·能力的比較，抑制能力強弱為：Ⅴgt;Ιgt;Ⅲgt;Ⅳgt;Ⅱ。其中水相提取物Ⅴ對OH·的抑制能力為(262±22)×103U/L，顯著高于其余各相提取物(Plt;0.01)。

3SephadexLH-20柱層析

提取物Ⅲ經Sephadex LH-20 凝膠柱分離，得到5種產物，分別為提取物A、B、C、D、E，其中提取物D及E抑制DPPH·能力最強，且抑制效果比同劑量的Vit C顯著，見表2。

圖2 所示為5種提取物抑制OH·能力的比較，提取物E、D均有抑制效應。提取物E對OH·的抑制能力最強，達(272±15)×103U/L，且強于1 g/L Vit C。

4絲瓜提取物E、D顯色反應

絲瓜提取物E、D經三氯化鋁顯色后呈現(xiàn)黃色斑點，紫外燈下觀察可見強熒光，表明其為黃酮類物質。

Figure 1. The inhibitory effect of different solvent extracts from Luffa cylindrica on OH·. Concentration of each extract was 5 g/L. Extract Ι: crude extract; extractⅡ: ligarine extract; extract Ⅲ:acetic ether extract; Extract Ⅳ:n-butanol extract; extract Ⅴ: water extract±s.n=3.**Plt;0.01 vs extract Ι;##Plt;0.01 vs extract Ⅲ.

表2 提取物Ⅲ分離后5種組分抑制DPPH·能力比較

Figure 2. The inhibitory effect of the five fractions of extract Ⅲ from Luffa cylindrica on OH·. Concentration of each fraction was 5 g/L.A:fraction A; B: fraction B; C: fraction C;D: fraction D; E: fraction E; Vit C: vitamin C±s.n=3.**Plt;0.01 vs Vit C ;##Plt;0.01 vs fraction D.

討 論

天然抗氧化物可有效地清除自由基，阻止脂蛋白發(fā)生氧化修飾，抑制脂質過氧化反應，從而抑制AS發(fā)生發(fā)展，預防心腦血管疾病。因此，尋找降血脂、抗脂蛋白氧化修飾的藥物，尤其是天然抗氧化物對AS的防治有臨床應用價值[16, 17]。

目前絲瓜或絲瓜絡發(fā)揮體內外抗氧化的物質基礎尚未清楚，從絲瓜獲取抗氧化有效成分是研究開發(fā)絲瓜抗AS藥物的基礎。我們前期的研究已發(fā)現(xiàn)，絲瓜初提液中含有豐富的多酚[9]。多酚為天然抗氧化物，廣泛存在于各種植物中，目前研究較多的有蘋果多酚、茶多酚、花青素等。多酚具有抗炎、抑菌、抗癌、抗動脈粥樣硬化等多種生物學活性，作用機制可能與其能夠清除機體內過剩的自由基有關[19-22]?，F(xiàn)已證實植物中多酚含量與其抗氧化能力呈量效關系[18]。因此，絲瓜的抗氧化效應亦可能是源于其所含的多酚類物質。

通過測定及比較不同階段提取物抗氧化能力的差異，篩選抗氧化活性成分。絲瓜初提液Ι經不同溶劑萃取后，得到提取物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ 4種產物。除石油醚相提取物Ⅱ外，其余各相提取物均對DPPH· 具有較強的抑制能力，其中乙酸乙酯相提取物Ⅲ的作用效果最顯著。提取物Ⅴ及Ⅲ均對OH·具有較強的抑制作用，提取物Ⅴ為水相萃取物，其主要成分可能為Vit C,經顯色反應檢驗，僅提取物Ⅲ符合黃酮類物質特征。因此，選取乙酸乙酯相提取物Ⅲ作進一步的分離。乙酸乙酯相提取物Ⅲ經凝膠柱層析后得5種產物：提取物A、B、C、D、E。其中提取物D、E對DPPH· 和OH·具有較強的抑制作用，且經顯色反應可判定為黃酮類物質。黃酮類物質為多酚家族中的重要成員，同樣具有抗炎、抗癌、抗動脈粥樣硬化、減輕缺血再灌注損傷等作用，其作用機制與黃酮類物質的抗氧化活性密切相關。具有降血脂、抗氧化作用的大豆黃酮(soybeanisoflavone,SI)、茶多酚(teaployphone,TP)、桑色素(morine) 等黃酮類化合物為近年研究的熱點。結合本課題組前期研究結果，絲瓜或絲瓜絡調節(jié)體內脂質代謝、維持氧化還原穩(wěn)態(tài)作用的物質基礎很可能是黃酮類化合物。

綜上所述，從絲瓜中分離得到的黃酮類物質可能是其發(fā)揮體內抗氧化作用的主要物質；絲瓜具有抗氧化效應，作為藥物或食物補充劑開發(fā)利用并應用于預防或延緩AS具有較好的應用前景。今后的研究工作將進一步分離純化絲瓜提取物D、E，以期獲得單體化合物并進行化學結構鑒定，為研究開發(fā)絲瓜天然抗氧化藥物提供實驗依據(jù)。

[1] Kunitomo M.Oxidative stress and atherosclerosis[J]. Yakugaku Zasshi,2007，127(12):1997-2014.

[2] Kostyuk VA, Potapovich AI, Suhan TO, et al. Antioxidant and signal modulation properties of plant polyphenols in controlling vascular inflammation[J]. Eur J Pharmacol, 2011, 658(2-3):248-256.

[3] Ginter E, Simko V. Garlic (AlliumsativumL.) and cardiovascular diseases[J]. Bratisl Lek Listy, 2010, 111(8):452-456.

[4] Ng YM, Yang Y, Sze KH, et al. Structural characterization and anti-HIV-1 activities of arginine/glutamate-rich polypeptide Luffin P1 from the seeds of sponge gourd (Luffacylindrica) [J]. J Struct Biol, 2011, 174(1):164-172.

[5] Khajuria A, Gupta A,Garai S, et al. Immunomodulatory effects of two sapogenins 1 and 2 isolated fromLuffacylindricain Balb/C mice [J]. Bioorg Med Chem Lett, 2007, 17(6):1608-1612.

[6] Parkash A, Nq TB, Tso WW, et al. Isolation and characterization of luffacylin, a ribo-some inactivating peptide with anti-fungal activity from sponge gourd (Luffacylindrica)seeds[J]. Peptides, 2002, 23(6):1019-1024.

[7] 關 穎, 李 菁, 朱偉杰, 等. 絲瓜絡對小鼠心肌缺血性損傷的預防效應[J]. 中國病理生理雜志, 2006, 22(1):68-71.

[8] 李 菁, 付詠梅, 朱偉杰, 等. 絲瓜絡對實驗性高血脂大鼠的降血脂效應[J]. 中國病理生理雜志, 2004, 20(7):1264-1266.

[9] 潘永勤，李 菁，朱偉杰，等. 絲瓜降血脂及抗氧化作用的實驗研究[J]. 中國病理生理雜志, 2008, 24(5):873-877.

[10]李小玲,李 菁, 朱偉杰, 等. 絲瓜絡對高脂血癥小鼠LDL-R基因表達的影響[J].中國病理生理雜志, 2009, 25( 6):1156-1159.

[11]Dasguptan, De B. Antioxidant activity of some leaf vegetables of India: A comparative study[J]. Food Chem, 2007, 101(2):471-474.

[12]Brand-Williams W, Cuvelier Me, Berset C. Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity[J]. LWT - Food Sci Technol, 1995,28(1):25-30.

[13] 張尊聽, 賀 云，劉謙光，等. 分光光度法測定太白山20種中草藥的抗氧化活性[J]. 分析試驗室, 2002, 21(2):50-52.

[14]De Beer D, Joubert E, Gelderblom WC, et al. Antioxidant activity of south african red and white cultivar wines: Free radical scavenging[J]. J Agric Food Chem, 2003,51(4):902-909.

[15]徐任生，陳仲良. 中草藥有效成分提取與分離[M]. 第2版. 上海:上?？茖W技術出版社, 1983.1325-1327.

[16]Sobenin IA, Pryanishnikov VV, Kunnova LM, et al. The effects of time-released garlic powder tablets on multifunctional cardiovascular risk in patients with coronary artery disease[J]. Lipids Health Dis, 2010, 9:119.

[17]Vislocky LM, Fernandez ML. Biomedical effects of grape products [J]. Nutr Rev, 2010, 68(11):656-670.

[18]Wong SP, Leong LP, Koh JHW. Antioxidant activities of aqueous extracts of selected plants[J]. Food Chem, 2006, 99(4):775-783.

[19]Santangelo C, Varì R, Scazzocchio B, et al. Polyphenols, intracellular signalling and inflammation[J]. Ann Ist Super Sanita, 2007, 43(4):394-405.

[20]Park I, Park KK, Park JH, et al. Isoliquiritigenin induces G2 and M phase arrest by inducing DNA damage and by inhibiting the metaphase/anaphase transition[J]. Cancer Lett, 2009, 277(2):174-181.

[21]Tan WF, Lin LP, Li MH, et al. Quercetin, a dietary-derived flavonoid, possesses antiangiogenic potential[J]. Eur J Pharmacol, 2003, 459(2-3):255-262.

[22]Tunon MJ, Garcia-Mediavilla MV, Sanchez-campos S, et al. Potential of flavonoids as anti-inflammatory agents: modulation of pro-inflammatory gene expression and signal transduction pathways[J]. Curr Drug Metab, 2009, 10(3):256-271.

AntioxidativeactivityofextractsfromLuffacylindrica

PAN Yong-qin1, LI Jing1, ZHU Wei-jie2, HE Hui-juan1

(1DepartmentofPathophysiology,SchoolofMedicine,2InstituteofReproductiveImmunology,CollegeofLifeScienceandTechnology,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tlijing62@126.com)

AIM: To isolate the active compounds ofLuffacylindricaand investigate their antioxidative activity.METHODSAntioxidants fromLuffacylindricawere isolated using solvent extraction and Sephadex column chromatography. Active compounds of the extracts were identified with the antioxidative activity assays.RESULTSWith solvent extracting procedure, four extracts (Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ and Ⅴ) were obtained. Among these extracts, extract Ⅲ had significant antioxidative activity, which exerted a potent scavenging effect for both DPPH· and OH· assays. For further purification, extract Ⅲ was subject to Sephadex column and five fractions ( A, B, C, D and E ) were isolated. Fraction D and E showed good efficiency on scavenging DPPH· and OH·, and exhibited flavanoid characteristics.CONCLUSIONLuffacylindricaefficiently scavenges free radical species, and flavanoid exerts this action.

Luffacylindrica; Antioxidation; Flavones; Free radicals

1000-4718(2011)11-2086-04

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.11.008

2011-05-25

2011-09-09

廣東省中醫(yī)藥管理局資助項目(No.粵中醫(yī)[2004]26號)；國家中醫(yī)藥管理局三級實驗室開放課題基金資助項目

△通訊作者 Tel:020-85220253;E-mail:tlijing62@126.com

# 現(xiàn)工作單位：廣東省水電二局醫(yī)院(潘永勤)；湖北中醫(yī)學院(賀惠娟)