陳振勇， 戴紅梅， 楊 鵬， 王延剛， 黃文廣， 馮賢松

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院綜合外科， 湖北 武漢 430022)

阻塞性黃疸對腸上皮細胞氯離子分泌影響的研究*

陳振勇△， 戴紅梅， 楊 鵬， 王延剛， 黃文廣， 馮賢松

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院綜合外科， 湖北 武漢 430022)

目的探討阻塞性黃疸(OJ)對腸上皮細胞氯離子分泌的影響。方法建立OJ大鼠模型，分別于膽管結(jié)扎7 d(OJ1組)和14 d(OJ2組)后，檢測實驗動物外周血Cl-濃度，取末端回腸上皮細胞體外培養(yǎng)，熒光分光光度法測量細胞內(nèi)Cl-濃度，全細胞膜片鉗技術(shù)檢測Cl-電流的改變，并用Western blotting法分析電壓門控氯離子通道蛋白2(ClC-2)表達的變化。結(jié)果OJ1組和OJ2組的血清Cl-濃度分別為(88.67±4.68)mmol/L 和(82.01±6.25)mmol/L，均低于對照組(均Plt;0.05)。細胞內(nèi)Cl-相對濃度，OJ1組(3.14±0.38)和OJ2組(3.55±0.47)均高于對照組(均Plt;0.05)。對照組腸上皮細胞Cl-電流，從-80 mV的(-15.45±7.56)pA/pF升到80 mV的(5.85±0.81)pA/pF，呈外向整流趨勢。OJ組Cl-平均電流密度絕對值逐漸減小，與對照組比較差異顯著(均Plt;0.05)。Western blotting分析顯示ClC-2蛋白表達條帶在90 kD附近，對條帶的定量分析表明，OJ1組為0.20±0.04，OJ2組為0.19±0.06，均低于對照組(0.27±0.06)(均Plt;0.05)，但OJ1、2組間比較沒有顯著差異(Pgt;0.05)。結(jié)論OJ抑制腸腔氯離子分泌，縮小上皮細胞內(nèi)外氯離子濃度差，減少Cl-外向電流，此作用與細胞膜上氯離子通道蛋白 2的表達降低有關(guān)。

黃疸, 梗塞性； 腸細胞； 氯化物通道

腸上皮具有離子運輸和屏障功能，從數(shù)量上說，腸腔液體分泌最初由跨上皮的氯離子分泌所驅(qū)動，而液體的吸收主要由與營養(yǎng)素一起消化吸收的鈉離子所提供，兩者間維持平衡并精密調(diào)控。電解質(zhì)跨上皮運輸涉及到膜運輸?shù)鞍?，氯通道蛋白即是與腸腔氯化物分泌有關(guān)的一種膜運輸?shù)鞍譡1]，其中2型電壓門控道氯離子通道 (type 2 voltage-gated chloride channel，ClC-2)發(fā)揮重要生理作用[2]。盡管隨著術(shù)前評估和術(shù)后護理的進展，阻塞性黃疸(obstructive jaundice,OJ)仍保持較高的發(fā)病率和死亡率，其中關(guān)鍵性的病理生理因素是腸屏障功能破壞，腸通透性增加，從而引起全身的內(nèi)毒素血癥[3]。其中的原因并不甚清楚，可能的機制包括腸上皮細胞緊密連接蛋白的改變、氧化應(yīng)激、上皮細胞增殖和凋亡平衡的破壞等[4]。OJ能造成全身和腸腔局部的影響，臨床上也可以觀察到OJ患者腸蠕動減弱和腸腔液體分泌障礙[5]，OJ對腸腔液體分泌的影響尚未見更多報道。我們從與腸腔氯離子分泌有關(guān)的ClC-2著手，探討OJ對氯離子分泌的影響，為研究OJ影響腸腔離子分泌與屏障功能障礙提供研究基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1動物與分組

健康Wistar大鼠50 只，雌雄不限，體重250-330 g，由同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供。按隨機數(shù)字表法分為3組：對照組(n=10)，不作任何操作，14 d后拉脫法處死；OJ1組(n=10)，采用10%水合氯醛(0.3 g/kg)腹腔注射麻醉，開腹手術(shù)結(jié)扎切斷膽總管后關(guān)腹，7 d后處死；OJ2組(n=10)同法制造模型，14 d后處死。動物腔靜脈穿刺抽血2 mL，應(yīng)用CX5全自動生化分析儀(Beckman)測定血清氯離子濃度。距回盲部10 cm處環(huán)形切取回腸，取1 mm×1 mm×1 mm大小的組織數(shù)塊。

2小腸上皮細胞體外培養(yǎng)[6]

組織塊剪碎，使用DMEM培養(yǎng)基[達爾伯克(氏)改良伊格爾(氏)培養(yǎng)基，Gibco]，加入0.15%胰蛋白酶10 mL，培養(yǎng)瓶垂直置于振蕩儀上室溫振蕩消化30 min，用含10%FBS的培養(yǎng)基10 mL終止消化。反復(fù)吹打消化后的細胞液5 min，將消化溶液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，1 000 r/min離心6 min，棄上清。加入細胞清洗液，再次吹打5 min，1 000 r/min，離心5 min。重復(fù)4次。用培養(yǎng)液重懸沉淀，種植于以2%明膠包被的24孔培養(yǎng)板，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48 h換液1次，培養(yǎng)7 d傳3-4代后進行實驗。

3腸上皮細胞內(nèi)Cl-濃度的測定[7]

熒光分光光度法測量細胞內(nèi)Cl-濃度。細胞懸液加入2 mL比色杯，加入氯離子敏感的熒光染料(MQAE， Molecular Probes)終濃度為5 mmol/L，于37 ℃2 h后用熒光光度計(RF-5301PC型熒光分光光度計，日本島津公司)測量熒光強度，激發(fā)波長365 nm，發(fā)射波長450 nm，每10 min計數(shù)1次。通過熒光強度的比值計算Cl-濃度。

4全細胞膜片鉗技術(shù)檢測腸上皮細胞Cl-電流的改變

參照文獻[8]方法，培養(yǎng)細胞靜置48 h后細胞懸液滴片，孵箱中4 h細胞鋪滿蓋玻片后開展膜片鉗實驗。拉制電極使其阻抗為3-4 MΩ。在全細胞模式下，用EPC-9膜片鉗放大器(HEKA，Lambrecht)檢測氯通道電流。鉗制電壓0 mV，測試電壓-80 mV～+80 mV，階躍10 mV，每個刺激保持500 ms，然后復(fù)極化到-80 mV。信號為Pulse軟件收集并存儲，實驗圖形采用Igor Pro分析軟件(Version 3.3)進行分析處理。

5腸上皮細胞ClC-2蛋白表達的變化

Western blotting分析。取黏膜組織100 mg，采用BCA法用紫外可見分光光度儀(Waters)測定蛋白濃度，取樣本10 μL預(yù)染，加入緩沖液；煮沸，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離。取出硝酸纖維膜(Costar)，染色，用含TBS-T洗膜4次后封閉。加入兔抗鼠CLC-2Ⅰ抗蛋白(Sigma)(1∶300稀釋)，以β-actin(武漢博士德產(chǎn)品)為內(nèi)參照。加入Ⅱ抗〔四甲基異硫酸羅丹明(TRITC)-山羊抗兔IgG，北京中山生物技術(shù)有限公司〕孵育。暗室下膠片顯影，掃描。Olympus BX41圖像采集系統(tǒng)收集圖片信息分析灰度。

6統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1動物血清Cl-濃度的改變

血清Cl-濃度即是細胞外Cl-濃度，結(jié)果表明OJ后細胞外Cl-濃度均低于對照組，并且OJ2組更低于OJ1組，差異顯著(均Plt;0.05),說明隨時間推移，梗阻程度加深，細胞外Cl-濃度下降更嚴重，見表1。

表1 OJ前后血清Cl-濃度的變化

2體外培養(yǎng)腸上皮細胞內(nèi)Cl-濃度的變化

熒光分光光度法測量的熒光強度間接反應(yīng)上皮細胞內(nèi)Cl-濃度的變化，見表2。OJ組的熒光強度均明顯高于對照組，并且OJ2組高于OJ1組(均Plt;0.05)。

表2 體外培養(yǎng)腸上皮細胞內(nèi)Cl-濃度的變化

3腸上皮細胞Cl-電流的改變

由于OJ后細胞內(nèi)外Cl-濃度均發(fā)生改變，因此必然存在Cl-電流的變化。通過全細胞膜片鉗技術(shù)檢測腸上皮細胞Cl-電流，發(fā)現(xiàn)正常情況下氯電流隨膜的去極化逐漸由負值向正值轉(zhuǎn)化，從-80mV的(-15.45±1.70) pA/pF升到80mV的(5.85±0.81) pA/pF，呈外向整流趨勢。同時，OJ1組從(-12.16±1.15)pA/pF上升到(4.69±0.65)pA/pF，OJ2組分別為(-11.55±1.26 )pA/pF和(4.57±0.76) pA/pF。Cl-平均電流密度變化的絕對值，OJ組均小于對照組(均Plt;0.05)，但OJ1組與OJ2組間比較沒有顯著差異(Pgt;0.05)，見圖1。

4腸上皮細胞ClC-2蛋白表達的變化

細胞內(nèi)外Cl-濃度和電流的變化與細胞表面的氯離子通道蛋白有關(guān)，ClC-2是廣泛分布的氯通道家族之一，已證實在胃壁細胞和小腸、結(jié)腸上皮細胞有分布，定位于胃腸道上皮細胞膜尖端[8]。Western blotting結(jié)果發(fā)現(xiàn)ClC-2表達條帶在90 kD附近，見圖2A，與文獻報道相似[9]。

Figure 1. The changes of Cl- current among the three groups.

Figure 2. ClC-2 protein expression±s.n=10.△Plt;0.05 vs control group; #Plt;0.05 vs OJ1 group.

通過圖像分析儀測量條帶的相對灰度值，定量結(jié)果分析表明，OJ1組為0.20±0.04，OJ2組為0.19±0.06，均顯著低于對照組(0.27±0.06)，Plt;0.05，但兩實驗組間比較無差異顯著(Pgt;0.05)，見圖2B。

討 論

OJ對機體的影響是全方位的，僅就胃腸道而言，能破壞腸黏膜屏障，其作用與腸上皮細胞緊密連接蛋白數(shù)量的減少和再分布有關(guān)[10]。OJ對腸黏膜屏障的損傷是關(guān)鍵性啟動因素，引起細菌及內(nèi)毒素血癥，進而引起炎性細胞因子的“瀑布樣”效應(yīng)，形成所謂“腸源性膿毒癥”。臨床上可以觀察到OJ患者腸蠕動減弱和腸腔液體分泌障礙，OJ是如何影響腸腔離子分泌尚未見更多研究。氯離子通過跨膜轉(zhuǎn)運和氯離子通道參與了幾乎已知的各種生物過程[5]，因此我們從氯離子入手，探討OJ對腸腔離子分泌的影響。

腸腔液體分泌依靠細胞內(nèi)外離子濃度差及腸上皮細胞的跨膜離子轉(zhuǎn)運，氯離子的通透性受胞外氯離子濃度的影響，許多陽離子如K+、Na+等也可通過氯通道。我們研究發(fā)現(xiàn)OJ降低細胞外Cl-濃度，升高細胞內(nèi)Cl-濃度，縮小細胞內(nèi)外Cl-濃度差，且這種濃度差在OJ2組大于OJ1組，說明隨OJ時間延長Cl-分泌影響更大。

臨床上OJ患者出現(xiàn)水、電解質(zhì)紊亂較常見，其中也包括Cl-失衡。原因在于液體、營養(yǎng)物質(zhì)攝入不足；合并感染導(dǎo)致嘔吐或發(fā)熱，液體丟失過多；內(nèi)毒素血癥和高膽紅素血癥致腎臟受損等[11]。我們的研究也證實隨OJ程度的加深，對Cl-分泌的抑制程度更大。

為更深入了解OJ影響Cl-分泌的機制，我們從氯離子電流和氯通道蛋白角度作進一步研究。細胞內(nèi)外Cl-濃度的變化可激活一種外向電流，即氯離子電流，該電流具有典型的外向整流特性。通過全細胞膜片鉗技術(shù)顯示，對照組Cl-平均電流密度從-80 mV的(-15.45±7.56 )pA/pF升到80 mV的(5.85±0.81) pA/pF，而OJ1組從(-12.16±4.68)pA/pF升到(4.69±0.65)pA/pF，OJ2組從(-11.55±6.25) pA/pF升到(4.57±0.76) pA/pF，OJ后腸上皮細胞Cl-平均電流密度變化幅度明顯小于對照組，說明OJ后Cl-外向電流受抑制，這也與細胞內(nèi)外Cl-濃度差減小是一致的。這種外向電流普遍存在于哺乳動物細胞內(nèi)，對維持細胞容積的動態(tài)平衡，調(diào)節(jié)細胞的電活動，以及對細胞內(nèi)pH值、細胞增殖與分化、細胞凋亡等多種生物學功能發(fā)揮重要作用[12]。Cl-外向電流的破壞也將損害腸上皮細胞的各種生理功能。

腸腔氯化物分泌和氯離子電流的產(chǎn)生與腸上皮細胞氯通道蛋白有關(guān)。氯通道是指分布于細胞膜上的一種通道蛋白，其不僅運輸氯離子，還廣泛地轉(zhuǎn)運其它陰離子或離子團。根據(jù)調(diào)節(jié)因子的差異，將氯通道分為6類：電壓門控氯通道(voltage- gated chloride channel，ClC型氯通道)、囊性纖維跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子、鈣激活氯通道、p64相關(guān)氯通道、容積調(diào)控陰離子通道和配體門控氯通道[13]。ClC型氯通道包括9個亞型，研究比較多的是ClC-2通道。ClC-2廣泛存在于機體的細胞膜和胞內(nèi)細胞器膜上[14]，在胃腸道上皮細胞內(nèi)定位于細胞膜尖端[15]，結(jié)構(gòu)上為同源二聚體，受電壓和H+、Cl-激活。在細胞電活動、容積調(diào)節(jié)、跨上皮物質(zhì)運輸、細胞內(nèi)pH調(diào)節(jié)、細胞免疫應(yīng)答[16]和細胞凋亡[17]中都發(fā)揮一定作用。

我們進一步研究OJ對腸上皮細胞ClC-2通道的影響。結(jié)果表明ClC-2蛋白表達條帶在90 kD左右，通過對表達條帶的定量分析也發(fā)現(xiàn)OJ組的ClC-2的表達量低于對照組，也說明OJ抑制了ClC-2的表達。這也與細胞內(nèi)外氯離子濃度差縮小，氯離子外向電流減小一致。

ClC-2不僅存在細胞膜上，在細胞內(nèi)也有大量存在，兩者間的ClC-2能循環(huán)利用，其作用類似于起運輸作用的脂質(zhì)筏，因此ClC-2運輸至膜及其在膜內(nèi)傳輸是調(diào)節(jié)ClC-2活性的方式之一[18]。ClC-2氯通道在因缺血受損的腸黏膜修復(fù)中具有重要作用[19]。研究表明ClC-2與環(huán)繞黏膜上皮細胞頂側(cè)的緊密連接具有共同的分布區(qū)域[20]，OJ能同時破壞緊密連接蛋白和ClC-2，是否可以推測OJ損傷腸黏膜屏障與ClC-2有關(guān)。探討OJ對腸腔離子分泌的影響，也將為OJ破壞腸黏膜屏障的機制尋找到新的突破方向。

[1] Barrett KE. New ways of thinking about (and teaching about) intestinal epithelial function[J]. Adv Physiol Educ, 2008, 32(1): 25-34.

[2] Rinke I,Artmann J,Stein V. ClC-2 voltage-gated channels constitute part of the background conductance and assist chloride extrusion[J]. J Neurosci, 2010, 30(13): 4776-4786.

[3] Wang N, Yu H, Ma J,et al. Evidence for tight junction protein disruption in intestinal mucosa of malignant obstructive jaundice patients[J]. Scand J Gastroenterol, 2010, 45(2): 191-199.

[4] Assimakopoulos SF, Scopa CD, Vagianos CE. Pathophysiology of increased intestinal permeability in obstructive jaundice[J]. World J Gastroenterol, 2007, 13(48):6458-6464.

[5] Assimakopoulos SF, Tsamandas AC, Louvros E,et al. Intestinal epithelial cell proliferation, apoptosis and expression of tight junction proteins in patients with obstructive jaundice[J]. Eur J Clin Invest, 2011, 41(2):117-125.

[6] 紀華英，陳其奎，曾 暉．小鼠小腸上皮細胞的體外原代培養(yǎng)[J]．醫(yī)學綜述，2010，16(9)：1417-1419．

[7] 周京紅，吳德政．氟哌啶醇在K562/Dox細胞中對P-糖蛋白及氯離子通道的影響[J]．中華腫瘤雜志，2005，27(2)：81-85．

[8] 王昌明，高尚邦，余維巍，等．大鼠肺動脈平滑肌細胞鈣激活氯通道電流的電生理檢測[J]．中國應(yīng)用生理學雜志，2007，23(3)：261-263,318．

[9] Cao L,Zhang XD,Liu X, et al.Chloride channels and transporters in human corneal epithelium[J]. Exp Eye Res, 2010,90(6):771-779．

[10]陳振勇，馮賢松，楊 鵬，等．不同營養(yǎng)方式對梗阻性黃疸大鼠腸緊密連接蛋白的影響[J]．中華實驗外科雜志，2010，27(1)：78-80．

[11]Clarke DL，Pillay Y，Anderson F，et al．The current standard of care in the periprocedural management of the patient with obstructive jaundice[J]．Ann R Coil Surg Engl，2006，88(7)：610-616.

[12]袁振宇，葉春玲．體積調(diào)節(jié)性氯離子通道的研究進展[J]．國外醫(yī)學：生理、病理科學與臨床分冊，2004，24(3)：295-298.

[13]Estévez R, Jentsch TJ. CLC chloride channels: correlatin structure with function[J]. Curr Opin Struct Biol, 2002, 12(4): 531-539.

[14]孔曉霞，李 揚，張宏宇，等．線粒體氯通道蛋白在過氧化氫誘導(dǎo)C6細胞損傷中的作用[J]．中國病理生理雜志，2008, 24 (3)：481-483．

[15]Michael C, Adil EB, Ryuji U, et al. Effect of a selective chloride channel activator, lubiprostone, on gastrointestinal transit, gastric sensory, and motor functions in healthy volunteers[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2006, 290(5): G942-G947.

[16]Yoshise Y, Ito K,Tsubone H, et al. Functional and molecular characterizations of chloride channels in rat pleural mesothelial cells[J]. Eur J Pharmacol, 2009,614(1-3): 22-29.

[17]蘇 靜，周 磊，孔曉霞，等．抑制氯通道CLCN2基因表達對順鉑誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤U251細胞損傷的影響[J]．中國病理生理雜志，2009, 25(5)：859-863．

[18]Isabel C, Maria IN, Leandro Z, et al. Rapid recycling of ClC-2 chloride channels between plasma membrane and endosomes: Role of a tyrosine endocytosis motif in surface retrieval[J]. J Cell Physiol, 2009, 221(3): 650-657.

[19]Nighot PK, Moeser AJ, Ryan KA,et al. ClC-2 is required for rapid restoration of epithelial tight junctions in ischemic-injured murine jejunum[J]. Exp Cell Res, 2009, 315(1): 110-118.

[20]Adam JM, Prashant KN, Kory JE, et al. Recovery of mucosal barrier function in ischemic porcine ileum and colon is stimulated by a novel agonist of the ClC-2 chloride channel, lubiprostone[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2007, 292(2):G647-G656.

AD大鼠模型中tau基因缺失引起軸突變性

Tau病變包括各種以細胞內(nèi)存在tau蛋白聚合物、有進行性癡呆和錐體外系癥狀為特征的進行性神經(jīng)退行性病變，如額顳葉癡呆、FTDP-17、PSP、CBD、Pick's病以及阿爾茨海默病(AD)。Tau病變發(fā)病機制的一個中心問題是tau蛋白功能障礙如何導(dǎo)致神經(jīng)退化。Dawson HN等早前已經(jīng)證實tau 蛋白的缺失與微管失穩(wěn)有關(guān)，并損傷軸突的外向生長。他們由此推測有功能的tau蛋白缺失可能使中樞神經(jīng)系統(tǒng)更易于發(fā)生例如突變的β-淀粉樣前體蛋白(β-APP)的過度表達以及外傷性腦損傷等的繼發(fā)性損傷。為此，他們將敲除tau基因的小鼠與過度表達突變?nèi)祟怉PP(APP670,671，Asw)的小鼠雜交，建立了一個新的小鼠模型Asw/mTau-/-，用以證實tau基因的缺失可引起神經(jīng)退行性病變。在tau基因被敲除的小鼠中，APP670,671的過度表達引出軸突球狀體的廣泛形成。他們注意到，能自身產(chǎn)生tau的小鼠若過度表達APP670,671，其球狀體的形成僅僅與Aβ沉積斑塊有關(guān)，而Asw/mTau-/-小鼠的球狀體不僅形成于Aβ沉積斑塊周圍，還形成于白質(zhì)束和神經(jīng)纖維網(wǎng)中，與Aβ沉積斑塊相關(guān)和營養(yǎng)障礙性神經(jīng)網(wǎng)軸突球狀體形成均為AD的顯著特征。因此，tau的缺失可以造成神經(jīng)退行性病變，過度表達突變的APP動物模型中tau的缺失加重神經(jīng)元的損傷，應(yīng)考慮針對tau 病變?yōu)榘悬c的神經(jīng)退行性疾病的治療方法。

Neuroscience, 2010, 169(1):516-531(逯 丹)

Effectsofobstructivejaundiceonenterocytechloridionsecretioninrats

CHEN Zhen-yong, DAI Hong-mei, YANG Peng, WANG Yan-gang, HUANG Wen-guang, FENG Xian-song

(DepartmentofGeneralSurgery,UnionHospital,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China.E-mail:xhczy@126.com)

AIM: To investigate the effects of obstructive jaundice (OJ) on enterocyte chloridion secretion in rats.METHODSThe OJ model of rats was set up. The rats were divided into OJ1 group and OJ2 group randomly. The animals in OJ1 group were sacrificed by exsanguination 7 days after operation and the rats in OJ2 group were sacrificed 14 days after operation. The Cl-concentration in peripheral blood was detected. The epithelial cells in the terminal ileum mucosas were culturedinvitro. The concentration of intracellular Cl-was detected by fluorospectrophotometry. The Cl-current was measured by whole-cell patch clamp experiments. Western blotting was used to examine the change of voltage-gated Cl-channel 2 protein (ClC-2) and the images were analyzed by image analysis system and statistical software quantitatively.RESULTSThe serum Cl-concentration in OJ1 group and OJ2 group were obviously lower than that in control group [(88.67±4.68) mmol/L and (82.01±6.25) mmol/Lvs(95.57±7.51) mmol/L, bothPlt;0.05]. The intracellular Cl-relative concentrations in OJ1 group and OJ2 group were higher than that in control group (3.14±0.38 and 3.55±0.47vs2.69±0.41,bothPlt;0.05). The Cl-current of normal epithelial cells displayed outward rectification, and transformed negative value into positive value following cell membrane depolarization. The Cl-current was (-15.45±7.56) pA/pF and (5.85±0.81) pA/pF when voltage was -80 mV and 80 mV. The ranges of upgrade of absolute values of average electric current density in OJ groups were lower than those in control group (allPlt;0.05). Western blotting analysis showed that the ClC-2 protein generated a broad band about 90 kD. The average gradations of Western blotting images were lower in OJ groups than that in control group (0.20±0.04 and 0.19±0.06vs0.27±0.06, bothPlt;0.05). However, no difference between the 2 OJ groups was observed (Pgt;0.05).CONCLUSIONThe chloridion secretion of intestinal epithelium is restrained in rats with OJ. The concentration gradient between exterior and interior of epithelial cells is decreased, and the Cl-outward current is reduced. All of above are concerned with downregulation of ClC-2 protein in cell membrane.

Jaundice,obstructive; Enterocytes; Chloride channels

1000-4718(2011)11-2194-05

R364.5

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.11.030

2011-05-17

2011-08-30

湖北省自然科學基金資助項目(No.2010CDB08005)

△ 通訊作者 Tel：027-85351530;E-mail：xhczy@126.com