劉朝巍, 劉仕昌, 張 濤, 楊 卓△

(南開大學(xué) 1醫(yī)學(xué)院生物活性材料教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2生命科學(xué)學(xué)院，天津 300071)

過氧亞硝酸陰離子供體通過蛋白激酶C途徑抑制CA1區(qū)神經(jīng)元延遲整流鉀電流*

劉朝巍1, 劉仕昌1, 張 濤2, 楊 卓1△

(南開大學(xué)1醫(yī)學(xué)院生物活性材料教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2生命科學(xué)學(xué)院，天津 300071)

目的： 過氧亞硝酸陰離子(ONOO-)是一種性質(zhì)活潑的自由基，可引起強(qiáng)的氧化性損傷，介導(dǎo)了一氧化氮(NO)的大部分毒性作用。本研究探討ONOO-對腦片海馬神經(jīng)元延遲整流鉀電流(IK)和動作電位時程(APD)的影響及其作用機(jī)制。方法應(yīng)用全細(xì)胞腦片膜片鉗技術(shù)記錄IK和動作電位。結(jié)果ONOO-供體SIN-1可抑制IK電流峰值，使其激活曲線向超極化方向移動，并可延長APD。腦片預(yù)處理PKC抑制劑chelerythrine (2.5 μmol/L)可抑制SIN-1對IK的作用。PKC激動劑PDBu (6 μmol/L)不僅加強(qiáng)而且模擬SIN-1對IK的影響。然而，鳥苷酸環(huán)化酶(GC)抑制劑ODQ對SIN-1的作用無影響。結(jié)論ONOO-可能通過PKC-IK-動作電位信號級聯(lián)反應(yīng)作用于海馬神經(jīng)元，并不依賴環(huán)磷鳥苷(cGMP)通路，這可能是ONOO-神經(jīng)毒性的機(jī)制之一。

海馬； 過氧亞硝酸； 延遲整流鉀電流； 蛋白激酶C； 膜片鉗術(shù)

一氧化氮(nitric oxide,NO)是一種非經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)，具有信使和細(xì)胞毒性雙重作用[1]，可與超氧陰離子快速反應(yīng)生成過氧亞硝酸陰離子(peroxynitrite,ONOO-)。ONOO-是一種性質(zhì)活潑的自由基，可引起強(qiáng)氧化性損傷，介導(dǎo)了NO的大部分毒性作用。ONOO-可能是導(dǎo)致細(xì)胞損傷、能量耗竭和細(xì)胞死亡的重要因素。ONOO-可作為強(qiáng)氧化劑，作用于酶、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及DNA等大分子物質(zhì)，產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，使細(xì)胞的代謝發(fā)生障礙及能量耗竭，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、損傷，甚至死亡。ONOO-參與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過程，例如：阿爾茨海默病、腦缺血和癲癇等[2-4]。

鉀通道是腦內(nèi)分布最廣、類型最多的一類離子通道，其中電壓門控鉀通道在調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性等生理功能中起著十分重要的作用。延遲整流鉀電流(delayed rectifier K+current,IK)是動作電位(action potential,AP)復(fù)極化過程的主要成分，影響AP的形狀和時程[5]。細(xì)胞膜的離子通道是許多毒性物質(zhì)的作用靶點(diǎn)，研究表明ONOO-可增加微動脈自發(fā)瞬時外向電流[6]，并抑制人平滑肌的鈣激活鉀電流[7]和基底外側(cè)的鉀通道電流[8]，氨氯吡咪敏感的鈉電流[9]。我們前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，ONOO-可以抑制海馬神經(jīng)元電壓門控鈉電流[10]。

蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)和環(huán)磷鳥苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)均可調(diào)節(jié)神經(jīng)元IK[11,12]。電壓門控鉀通道的氨基酸序列存在許多PKC調(diào)節(jié)位點(diǎn)并可被cGMP信號通路調(diào)節(jié)。本研究主要通過研究ONOO-對海馬神經(jīng)元IK和AP的影響及其可能的調(diào)節(jié)機(jī)制，探討ONOO-神經(jīng)毒性的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物 出生后14-18 d的雄性Wistar大鼠，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2試劑藥品 SIN-1、MnTBAP、chelerythrine和PDBu購自Alexis。ODQ為Canmay產(chǎn)品。河豚毒素(anhydrotetrodotoxin 4-epitetrodotoxin，tetrodonic acid,TTX)為秦皇島河北省水產(chǎn)科技開發(fā)公司產(chǎn)品。其余試劑為國產(chǎn)分析純。

2方法

2.1腦片制備 實(shí)驗(yàn)動物用水合氯醛(400 mg/kg，ip)腹腔麻醉。待麻醉適度后，迅速斷頭、剪開顱骨取出全腦，置于備好的腦脊液中靜置2 min。分離海馬，使用振動切片機(jī)(Leica VT1 000M)將其切為厚度為400 μm的腦片。厚度較均勻的腦片移入30 ℃已通混合氣的ACSF中，孵育1h以上備用。

2.2全細(xì)胞膜片鉗記錄 利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄大鼠腦片海馬CA1區(qū)神經(jīng)元IK。電極由PIP5型拉制儀(PIP5，HEKA)分兩步拉制而成。充滿電極內(nèi)液后阻抗為2-6 MΩ。

將正置顯微鏡低倍鏡的鏡頭選準(zhǔn)所要記錄腦片的位置，然后換成高倍鏡。將高倍鏡頭浸入液體，適當(dāng)調(diào)節(jié)焦距就可通過電荷耦合器件(charge-coupled device,CCD)攝像機(jī)在TV監(jiān)視器屏幕上看到放大的細(xì)胞圖像。為使細(xì)胞圖像更清晰，用紅外光代替普通光，其差分干涉對比度顯微鏡(differential inter-

ference contract,DIC)圖像在黑白TV監(jiān)視器屏幕上會更有立體感。選擇表面光滑、形態(tài)飽滿、輪廓分明、折光性好的錐體神經(jīng)元。電極尖端與細(xì)胞膜形成高阻封接(大于1GΩ)后，負(fù)壓破膜，使電極內(nèi)液與細(xì)胞內(nèi)液相通，形成全細(xì)胞狀態(tài)，在電壓鉗下記錄IK電流。信號采集頻率：10 kHz；濾波頻率：3 kHz。采樣后數(shù)據(jù)由PULSE 10.0軟件自動記錄，存儲于計(jì)算機(jī)硬盤內(nèi)供分析。所有的實(shí)驗(yàn)均在室溫(22-24 ℃)下進(jìn)行。

2.3藥物處理 SIN-1和ODQ溶解于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)，配置成母液；MnTBAP、chelerythrine和PDBu溶解于人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)中。所有藥物均在使用前用ACSF稀釋，以備灌流使用，DMSO的終濃度小于0.1％。灌流速度約3-4 mL/min，灌流過程中持續(xù)通混合氣(5％ CO2和95％ O2)以保證細(xì)胞外酸堿度穩(wěn)定。ACSF(mmol/L)：125 NaCl,25 NaHCO3,1.25 KCl,1.25 KH2PO4,1.5 MgCl2,2.0 CaCl2,16 glucose。記錄K+電流電極內(nèi)液成分(mmol/L)：NaCl 5,KCl 144.4,MgCl21,EGTA 3,HEPES 10 (用10 mmol/L NaOH調(diào)至pH 7.3 )；記錄AP電極內(nèi)液成分：NaCl 5,KCl 144.4,MgCl21,EGTA 3,HEPES 1。KOH調(diào)節(jié)pH至 7.2-7.3。

3數(shù)據(jù)學(xué)處理

結(jié) 果

1IK的分離

由于電壓依賴性外向鉀電流包括瞬時外向鉀電流(transient outside potassium current,IA)和IK兩種，且二者均可以在細(xì)胞膜受到去極化時激活，所以要記錄到IK有必要先將IA分離出去。由于IA激活的電壓大約在-60 mV，失活電壓在-50 mV，而IK的激活電壓在-50 mV或更高，所以可以根據(jù)兩者不同的電壓依賴性采用電壓分離的方法得到較單純的IK。如圖1A所示，在-110 mV的前置脈沖電位(prepulse)后插入一段50 ms的-50 mV的中間電位(interpulse)，然后再去極化到+60 mV，可以使IA幾乎完全失活而記錄到一個激活和失活都比較緩慢的外向電流，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步用IK通道的特異性阻斷劑四乙銨(tetraethylammonium，TEA)進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)TEA可以劑量依賴地抑制該電流，30 mmol/L TEA可以完全抑制(數(shù)據(jù)未出示)，說明我們所記錄的就是IK。

Figure 1.Effects of treatment with 500 μmol/L SIN-1 for 5 min on the I-V curves (B) and activation kinetics(C) of IK±s.n=6.*Plt;0.05 vs control.Currents were generated by applying depolarizing pulses,a 1 000-ms hyperpolarizing prepulse to -110 mV followed by interpluse in -50 mV for 50 ms and then step depolarized to potential from -50 to +60 mV for 450 ms with a 10 mV increment.The holding potential was -50 mV(A).

2ONOO-對IK的影響

SIN-1是ONOO-的供體，可同時產(chǎn)生NO和超氧陰離子。圖2A顯示SIN-1(10、500、1 000 μmol/L)可抑制IK，并呈現(xiàn)濃度依賴性。給予超氧化物歧化酶模擬劑MnTBAP(100 μmol/L)和SIN-1(500 μmol/L)對IK無明顯影響，見圖2A、B。結(jié)果表明SIN-1對IK的抑制是由ONOO-產(chǎn)生的，與超氧陰離子無關(guān)。

Figure 2.Effects of ONOO- on IK in hippocampal slices.Original current traces (A) and bar graph (B) showed the effects of SIN-1 at 10 μmol/L,500 μmol/L,and 1 000 μmol/L and co-treatment with 500 μmol/L SIN-1 and 100 μmol/L MnTBAP on the amplitude of IK.±s.n=8 .*Plt;0.05 vs control.

3ONOO-對IK的I-V曲線和激活動力學(xué)的影響

SIN-1可使IK的I-V曲線降低，見圖1B，然而同時給予SIN-1和MnTBAP對IK的I-V曲線無顯著影響(數(shù)據(jù)未出示)。利用公式G=I/(V-Vr)將電流值轉(zhuǎn)換為電導(dǎo)值，其中G為電導(dǎo)，V為膜電位，Vr為翻轉(zhuǎn)電位。以電導(dǎo)值與最大電導(dǎo)值的比值(G/Gmax)對應(yīng)膜電位繪制出給藥前后的激活曲線。所得曲線用Boltzmann方程G/Gmax=1-1/{1+exp[(V-Vh)]/k}進(jìn)行擬合，式中G為電導(dǎo)，V為膜電位，Vh為半數(shù)激活電壓，k為斜率因子。IK的激活曲線均呈S形。經(jīng)擬合得出SIN-1給藥前后IK的Vh分別為(44.9±3.4) mV 和(29.2±8.3) mV,(n=6,Plt;0.05)，k值分別為23.2±3.4 和 33.0±4.5 (n=6,Plt;0.05)。說明ONOO-可使IK的激活曲線左移并改變其斜率因子，見圖1C。

4SIN-1通過PKC途徑抑制IK與鳥苷酸環(huán)化酶(guanylatecyclase,GC)途徑無關(guān)

圖3顯示應(yīng)用特異性的GC抑制劑ODQ對SIN-1誘導(dǎo)的IK的改變無顯著影響(Pgt;0.05)。

Figure 3.Activation of PKC-IK-AP (action potential) signaling cascades participated in the effect of ONOO- on IK of hippocampal neurons.A:original current traces showed ODQ had no effects on the action of SIN-1,but chelerythrine inhibited and PBDu strengthened the action of SIN-1;B:bar graph showed the summary variation of IK in the presence of 500 μmol/L SIN-1,chelerythrine and SIN-1,PDBu,PDBu and SIN-1,ODQ and SIN-1 .±s.n=6.*Plt;0.05,**Plt;0.01 vs control; #Plt;0.05 vs SIN-1.

PKC抑制劑chelerythrine (2.5 μmol/L)預(yù)處理腦片10 min，可抑制SIN-1對IK的作用。PKC激動劑PDBu(6 μmol/L)預(yù)處理腦片，SIN-1對IK的抑制作用增強(qiáng)(Plt;0.05)。另外，PDBu能模擬SIN-1對IK的抑制作用(Plt;0.05)。以上結(jié)果表明SIN-1可能通過PKC通路抑制IK，而與cGMP通路無關(guān)。

5ONOO-對AP的影響

用10 ms的去極化刺激誘發(fā)加藥前后單個AP,見圖4A。IK是AP復(fù)極化的主要成分。SIN-1可明顯延長動作電位時程，見圖4B。

Figure 4.Effects of SIN-1 on action potential(AP) of hippocampal neurons.A:single AP was elicited using a 10 ms depolarizing current pulse in control group and treatment with 500 μmol/L SIN-1 for 5 min;B:bar graph showed the effect of 500 μmol/L SIN-1 on action potential duration(APD) in neurons .±s.n=8.**Plt;0.01 vs control.

討 論

ONOO-在體內(nèi)主要是由NO和超氧陰離子反應(yīng)生成的，反應(yīng)速率常數(shù)為6.7×109mol·L-1·s-1，接近于被動擴(kuò)散的速度。ONOO-是較NO和超氧陰離子氧化作用更強(qiáng)、更廣泛的氧化劑，參與了多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過程。SIN-1可同時產(chǎn)生超氧陰離子和NO，迅速結(jié)合生成ONOO-。本實(shí)驗(yàn)中，不同劑量的SIN-1可抑制IK，而SIN-1和MnTBAP共同作用時，IK無明顯變化，表明ONOO-可抑制IK，且這種作用呈現(xiàn)劑量依賴性。

IK的改變可參與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過程，如腦缺血、癲癇等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ONOO-抑制海馬神經(jīng)元IK，并使APD明顯延長；IK的抑制劑TEA也可導(dǎo)致APD明顯延長[13]，提示ONOO-的毒性作用可能部分通過抑制IK從而影響AP。我們前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)ONOO-可抑制神經(jīng)元AP的發(fā)放頻率[10]，既然IK是AP復(fù)極化的主要成份，是神經(jīng)元興奮性的決定因素之一，ONOO-對神經(jīng)元興奮性的影響可能部分是通過抑制IK實(shí)現(xiàn)的。

PKC和cGMP可調(diào)節(jié)多種離子通道。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PKC抑制劑chelerythrine (2.5 μmol/L)可抑制ONOO-對IK的作用。PKC激動劑PDBu (6 μmol/L)不僅加強(qiáng)而且模擬ONOO-的作用。這些結(jié)果表明PKC可能參與IK的抑制作用。而GC的抑制劑ODQ對SIN-1的作用無明顯影響，提示cGMP信號通路與SIN-1對IK的作用無關(guān)。Malan等[14]的研究結(jié)果也表明cGMP不參與ONOO-對河豚豬心室肌細(xì)胞鈣電流的作用。但我們的前期結(jié)果提示ONOO-通過GC途徑抑制海馬神經(jīng)元電壓門鈉電流[10]，這些不同的結(jié)果提示ONOO-對通道作用的調(diào)控機(jī)制可能具有特異性。

蛋白通道氨基酸殘基的修飾可能參與ONOO-誘導(dǎo)的IK電流的改變。海馬神經(jīng)元電壓門控鉀通道對氧化損傷十分敏感[15]。ONOO-可氧化巰基從而抑制上皮細(xì)胞的鈉通道電流[8]。另外ONOO-可導(dǎo)致蛋白質(zhì)酪氨酸硝基化，有報(bào)道證實(shí)ONOO-可硝基化電壓門控的鉀通道蛋白，損害其功能[16]。

總之，我們的研究表明ONOO-通過PKC-IK-AP信號級聯(lián)系統(tǒng)作用于海馬神經(jīng)元，并與cGMP通路無關(guān)，這可能是ONOO-的神經(jīng)毒性的機(jī)制之一。

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PeroxynitritedonorinhibitsIKcurrentviaproteinkinaseCinhippocampalCA1neurons

LIU Zhao-wei1,LIU Shi-chang1,ZHANG Tao2,YANG Zhuo1

(1ThekeyLaboratoryofBioactiveMaterials,MinistryofEducation,SchoolofMedicine,2CollegeofLifeScience,NankaiUniversity,Tianjin300071,China.E-mail:zhuoyang@nankai.edu.cn)

AIM: To investigate the effects of peroxynitrite (ONOO-) on delayed rectifier potassium currents (IK) and action potential duration (APD).METHODSThe technique of whole cell patch-clamp was used in hippocampal slices andIKcurrent of the CA1 neurons was recorded.RESULTSSIN-1,an ONOO-donor,inhibited amplitudes ofIKcurrent and produced a hyperpolarizing shift in the activation-voltage curve.The application of SIN-1 resulted in a marked prolongation of APD.The responses of the CA1 neurons to ONOO-were inhibited by 2.5 μmol/L chelerythrine,an inhibitor of protein kinase C (PKC).The PKC activator PDBu (6 μmol/L) did not enhance but mimicked the effects.However,the guanylate cyclase inhibitor ODQ did not block the effects of ONOO-.CONCLUSIONThe effects of ONOO-on hippocampal neurons are mediated through activation of the signaling cascades of PKC-IK-action potential and are independent of cyclic guanosine monophosphate pathway,indicating the underlying mechanism related to neurotoxicity of ONOO-.

Hippocampus; Peroxynitrous acid; Delayed rectifier potassium currents; Protein kinase C; Patch-clamp techniques

1000-4718(2011)05-0900-05

R322.81

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.013

2010-10-25

2011-03-09

國家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(No.31000509)；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(No.10JCZDJC19100)

△通訊作者 Tel：022-23504364；E-mail：zhuoyang@nankai.edu.cn