蔡雪洲，丁未堯，謝　航，徐華榮，蔡　飛，李彩蓉

(1.湖北科技學(xué)院糖尿病心腦血管病變湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 咸寧 437100;2.湖北科技學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院)

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二甲雙胍對(duì)過(guò)氧化氫所致腦片損傷的作用研究*

蔡雪洲1，丁未堯1，謝航1，徐華榮1，蔡飛1，李彩蓉2**

(1.湖北科技學(xué)院糖尿病心腦血管病變湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 咸寧 437100;2.湖北科技學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院)

摘要：目的 探討二甲雙胍對(duì)過(guò)氧化氫(H2O2)所致腦片損傷的保護(hù)作用。方法 通過(guò)H2O2孵育制備小鼠腦片損傷模型，預(yù)先給予不同濃度的二甲雙胍進(jìn)行干預(yù)。觀察小鼠腦片TTC染色情況，測(cè)定TTC染色產(chǎn)物formazan的含量及腦片LDH的釋放率。結(jié)果 H2O2可導(dǎo)致腦片TTC染色變淺、formazan含量減少及LDH含量增加，預(yù)先給予二甲雙胍可劑量依耐性的增加腦片染色、增加formazan含量及減少LDH含量。結(jié)論 二甲雙胍對(duì)H2O2所致的腦片損傷有一定的保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：腦片；過(guò)氧化氫；二甲雙胍；TTC

糖尿病是一種以慢性高血糖為特征的代謝性疾病，過(guò)量的氧自由基是糖尿病及其并發(fā)癥損傷組織器官最重要的因素之一。氧自由基不但可以直接損傷細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞壞死，它還可以通過(guò)介導(dǎo)線粒體途徑及轉(zhuǎn)錄因子等間接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。過(guò)氧化氫(H2O2)為強(qiáng)的氧化劑，作用于機(jī)體使機(jī)體氧自由基代謝失衡導(dǎo)致?lián)p傷。腦片介于整體和細(xì)胞之間，既保持了神經(jīng)元與其他神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞的相互關(guān)系，又排除了體溫、pH值、離子濃度變化等因素干擾，可在嚴(yán)格控制的條件下觀察[1，2]，故建立離體腦片H2O2損傷模型可為新型定量分析提供基礎(chǔ)。

二甲雙胍為雙胍類口服降血糖藥，具有確切的抗氧化作用[3]，有體外研究證實(shí)二甲雙胍可劑量依賴性與羥自由基發(fā)生反應(yīng)[4]。本文旨在通過(guò)H2O2腦片損傷模型探討二甲雙胍對(duì)氧化損傷的保護(hù)作用，為二甲雙胍在糖尿病腦組織損傷的防治方面提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物動(dòng)物：雄性昆明種小鼠，體重20～25g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(鄂)2015-0018。

1.2主要試劑30%過(guò)氧化氫(分析純，廣東西隴化工廠)；2，3，5-三苯基氯化四氮唑(2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)用0.2mol/L的磷酸緩沖液(pH7.4)配制成1%的溶液，避光保存。人工腦脊液(ACSF)的配制(pH=7.4)(所用試劑均為分析純)：NaCl，7.247g/L;KCl，0.224g/L;NaHCO3，2.184g/L;NaH2PO4·2H2O，0.193g/L;MgSO4·7H2O，0.493g/L;CaCl2，0.222g/L;C6H12O6·H2O，1.982g/L。乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑檢測(cè)盒購(gòu)自南京建成生物制品有限公司。

1.3全腦腦片及過(guò)氧化氫模型的制備稱取小鼠體重后頸椎脫臼處死，迅速斷頭，取出全腦，棄去小腦，立即固定在切片臺(tái)上浸入預(yù)先凍成冰水混合液的通有混合氣體(95%O2+5%CO2)的人工腦脊液中，分別用振動(dòng)切片機(jī)沿縱軸切成600 μm的腦片(通?？汕?～6片)，保持腦片孵育時(shí)不重疊。分別置于不同條件下于28℃孵育，在孵育的過(guò)程中持續(xù)通入混合氣體，調(diào)節(jié)氣流量，避免腦片受到氣流的沖擊，孵育過(guò)程中避免腦片的重疊、擠壓等影響腦片的活性。孵育完畢，一部分腦片用于TTC染色，另一部分腦片保存于-80℃用于生化指標(biāo)的測(cè)定。

實(shí)驗(yàn)分組：分為四組，每組8只小鼠，分別切成腦片。正常組在人工腦脊液中孵育90min；模型組在人工腦脊液中孵育30min后，轉(zhuǎn)為含2mmol/L H2O2的人工腦脊液中孵育60min；低劑量組在含25mmol/L二甲雙胍的人工腦脊液中孵育30min后轉(zhuǎn)為含2mmol/L H2O2的人工腦脊液中孵育60min；高劑量組在含50mmol/L二甲雙胍的人工腦脊液中孵育30min后轉(zhuǎn)為含2mmol/L H2O2的人工腦脊液中孵育60min。

1.4TTC染色及染色產(chǎn)物的測(cè)定將四組腦片轉(zhuǎn)至24孔板中，加入3ml的1%TTC溶液于37℃下避光顯色30min，取出后將同一組腦片取出后平鋪于玻璃板上拍照觀察。

拍照后用濾紙吸去表面水分，稱取濕重，以每克腦片20ml的比例加入提取液(乙醇∶二甲基亞砜=1∶1)，避光在37℃水浴搖1h，密閉容器避光放置24h，按每孔200uL加入對(duì)應(yīng)的提取后的溶液于酶標(biāo)板中，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在490nm處吸光度值(A490)。

1.5LDH的測(cè)定將凍存于EP管中腦片解凍，稱重，按1∶9的比例加入生理鹽水，在50Hz冷凍條件下勻漿5min，然后用冷凍離心機(jī)12000rpm離心15min，取上清液，即10%的腦組織勻漿液。用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度，蛋白勻漿液稀釋至0.02%后參照LDH試劑盒說(shuō)明書(shū)，測(cè)定腦片LDH的活性(組織中LDH活性=(測(cè)定OD值-對(duì)照OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)*標(biāo)準(zhǔn)品濃度/蛋白濃度)。

2結(jié)果

2.1二甲雙胍對(duì)H2O2所致腦片損傷TTC染色的影響TTC可被活細(xì)胞中的具有還原性的酶還原生成粉紅色的甲臜(formazan)，腦片活性越大則formazan含量越高，顏色越深，A490值越大。與正常組相比，模型組損傷嚴(yán)重。而預(yù)先加入25mmol/L二甲雙胍的低劑量組和加入50mmol/L二甲雙胍的高劑量組都有明顯的改善，且高劑量組的作用較低劑量組的作用要強(qiáng)，則表明二甲雙胍對(duì)H2O2的損傷有一定的保護(hù)作用(圖1)(封二)。

2.2二甲雙胍對(duì)H2O2所致腦片損傷TTC染色產(chǎn)物的影響 取TTC染色后的腦片于乙醇和二甲基亞砜的混合液洗脫后，在490nm處測(cè)定吸光度A490。正常組的A490平均值最高(3.668)，與模型組(2.298)相比，低劑量組(2.753)和高劑量組(3.152)A490依次增加(圖2)。

圖2　二甲雙胍對(duì)H2O2所致腦片損傷TTC染色產(chǎn)物的影響

2.3二甲雙胍對(duì)H2O2所致腦片損傷LDH的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，與模型組相比，低劑量組和高劑量組LDH釋放量依次降低，總抗氧化能力增加(圖3)。

圖3　二甲雙胍對(duì)H2O2所致腦片損傷LDH的影響

3討論

糖尿病可導(dǎo)致多種器官損傷，糖尿病慢性并發(fā)癥遍及全身，是其致死致殘的主要原因。糖尿病可導(dǎo)致糖尿病腎病、心肌病、周?chē)窠?jīng)病變、視網(wǎng)膜病變及中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變。既往研究表明，糖尿病中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變特別是認(rèn)知損傷的可能發(fā)病機(jī)制與腦血管病變、氧化應(yīng)激(如H2O2)、糖基化終末產(chǎn)物增多、神經(jīng)生長(zhǎng)因子缺乏、細(xì)胞存活信息傳導(dǎo)通路的障礙、神經(jīng)細(xì)胞凋亡等有關(guān)。但有關(guān)糖尿病認(rèn)知障礙的具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚，需做進(jìn)一步的研究。

二甲雙胍源于植物法國(guó)丁香的提取物，是2型糖尿病一線治療藥物，廣泛應(yīng)用于臨床。二甲雙胍的降糖作用主要是通過(guò)減少肝臟葡萄糖產(chǎn)生以及增強(qiáng)胰島素刺激下的外周組織對(duì)葡萄糖的攝取，減少小腸葡萄糖的吸收。二甲雙胍除了能夠降低血糖，改善胰島素抵抗之外，還具有心血管保護(hù)作用。但對(duì)糖尿病中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。

腦片因模擬在體腦環(huán)境及避免機(jī)體因素的作用，對(duì)于腦功能的研究越來(lái)越廣泛。TTC染色、TTC染色產(chǎn)物formazan測(cè)定及一些生化指標(biāo)檢測(cè)多用于腦片過(guò)氧化氫損傷模型實(shí)驗(yàn)中用于檢測(cè)腦損傷及其恢復(fù)情況[5～7]。LDH作為細(xì)胞內(nèi)標(biāo)志酶，是糖的無(wú)氧酵解和糖異生的重要酶系之一。當(dāng)神經(jīng)元受損、膜通透性改變時(shí)，LDH漏出量明顯增加，是反映神經(jīng)細(xì)胞損傷的可靠生化指標(biāo)[8，9]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，二甲雙胍(25mmol/L和50mmol/L)可對(duì)抗H2O2引起小鼠腦片的損傷，二甲雙胍可能通過(guò)減輕H2O2致小鼠腦片的氧化應(yīng)激損傷，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，從而延緩氧自由基所致的神經(jīng)細(xì)胞損傷和死亡。有文獻(xiàn)報(bào)道二甲雙胍的“氧化有益”假說(shuō)，二甲雙胍能促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的合成，Nrf2是抗氧化系統(tǒng)的總司令，是各類抗氧化酶的控制樞紐，故二甲雙胍的對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)氧化損傷的保護(hù)作用還有待進(jìn)一步的研究。

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Protective Effect of Metformin on Brain Slice Injury Induced by Hydrogen Peroxide in Mice

CAI Xue-zhou，DING Wei-yao，LI Cai-rong,et al

(HubeiUniversityofScienceandTechnology,XianningHubei437100,China)

ABSTRACT：Objective To observe the protective effect of metformin on brain slice injury induced by hydrogen peroxide in mice. Methods The brain slice injury model was induced by incubation with hydrogen peroxide and was treated with different concentrations of metformin.TTC staining，the contents of formazan and LDH were tested to assess the brain slice injury.Results Hydrogen peroxidereduced the color of TTC staining and the content of formazan，increased the content of LDH.Administration of metformin dose-dependently increased the color of TTC staining and the content of formazan，decreased the content of LDH.Conclusion Metformin has protective effect on brain slice injury induced by hydrogen peroxide.

KEY WORDS：Brain Slice;Hydrogen peroxide；Metformin;TTC

(收稿日期：2015-12-16)

DOI:10.16751/j.cnki.2095-4646.2016.02.096

中圖分類號(hào)：R-332

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：2095-4646(2016)02-096-03

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81470049)；湖北省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目(1503)

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