何一博，南麗紅，黃　枚，鄭燕芳，楊　瀾，謝晴晴，李　煌（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

·實驗研究·

芍藥苷對OGD海馬腦片中NLRP3炎癥小體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響

何一博，南麗紅，黃枚，鄭燕芳，楊瀾，謝晴晴，李煌
（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

目的通過新生大鼠氧糖剝奪（OGD）海馬腦片模型，觀察芍藥苷對OGD損傷后的海馬腦片中NLRP3炎癥小體組成蛋白及其所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響。方法將培養(yǎng)14 d的海馬腦片隨機(jī)分為5組：空白對照組、OGD組、芍藥苷低劑量組（1μM）、芍藥苷中劑量組（10μM）、芍藥苷高劑量組（100μM）。除空白對照組外，其他各組海馬腦片均吸棄腦片培養(yǎng)液后，加入1 m L PBS，并置于三氣培養(yǎng)箱中孵育45 m in后，給予相應(yīng)的藥物干預(yù)。24 h后取各組海馬腦片分別采用TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡率；RT-qPCR法檢測NLRP3炎癥小體組成蛋白mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果OGD組較空白對照組NLRP3炎癥小體組成蛋白m RNA的表達(dá)量和細(xì)胞凋亡率均明顯增高（P＜0.01），芍藥苷干預(yù)后NLRP3炎癥小體組成蛋白的mRNA表達(dá)量和細(xì)胞凋亡率均明顯低于OGD組（P＜0.01）。結(jié)論芍藥苷可通過下調(diào)OGD海馬腦片中NLRP3炎癥小體組成蛋白的表達(dá)，從而產(chǎn)生抗細(xì)胞凋亡的作用。

海馬腦片；氧糖剝奪；芍藥苷；NLRP3炎癥小體；細(xì)胞凋亡；腦梗死

腦中風(fēng)是全球第二大致死性疾病，每年可導(dǎo)致約600萬人死亡。近年的研究顯示神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域3（NOD-like receptor pyrin containing 1，NLRP3）炎癥小體可能在缺血性腦中風(fēng)中扮演著重要角色，炎癥小體激活后，半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase-1）可隨之激活引起細(xì)胞凋亡，阻斷或抑制NLRP3炎癥小體的活化可成為缺血性腦血管病新的治療靶點［1］。器官型海馬腦片因避免了血腦屏障、離子濃度變化、溫度、pH值等個體差異的影響，較好保留了組織的結(jié)構(gòu)和完整的神經(jīng)回路，可模擬體內(nèi)的生理環(huán)境［2］。而海馬是腦組織對缺氧最敏感的部位之一，故海馬腦片被廣泛應(yīng)用于腦缺氧損傷機(jī)制和藥物保護(hù)作用的研究，已成為較理想的離體缺氧損傷模型。

研究顯示，中藥對此有一定的效果［3-4］。芍藥苷是從毛莨科植物芍藥根中提取的具有生物活性的單萜糖苷類成分，已有研究報道其可在缺血性腦損傷中通過抗細(xì)胞凋亡而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［5］，但有關(guān)芍藥苷對NLRP3炎癥小體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響目前尚未見相關(guān)報道。故本研究擬在建立氧糖剝奪（oxygen-glucose deprivation，OGD）海馬腦片的基礎(chǔ)上，觀察芍藥苷對NLRP3炎癥小體組成蛋白的表達(dá)及其所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響，為芍藥苷對腦卒中的治療作用提供實驗依據(jù)。

1實驗材料

1.1實驗動物清潔級P7-9 SD乳鼠由福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（閩）2012-0001。

1.2主要儀器Millicell-CM插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿（美國Millipore公司）；5 000mz型振動切片機(jī)（英國Campden Instruments公司）；Forma 371型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific公司）；Galaxy CO170R型三氣培養(yǎng)箱（美國NBS公司）；LSM710激光掃描共聚焦顯微鏡（德國ZEISS公司）；7900HT Fast Realtime PCR System（美國ABI公司）；C1000TM Thermal cycler PCR擴(kuò)增儀（美國BIO-RAD公司）。

1.3主要試劑MEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司，SH30024）；Hank's平衡鹽溶液（美國Hyclone公司，SH30030）；細(xì)胞培養(yǎng)用青鏈霉素（美國Hyclone公司，J130071）；馬血清（美國Gibco公司，1296647）；DeadEndTMFluorometric TUNEL試劑盒（美國Promega公司，G3250）；EZgene BiozolRNA Kit（美國BIOMEGA公司，R7311）；HiScript?Q RT SuperMix for Qpcr（+ DNA wiper）（南京Vayzme公司，R123-01）；ChamQTM SYBR?Qpcr Master Mix（南京Vayzme公司，Q311-02/03）。

1.4實驗藥物芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品由上海源葉生物科技有限公司提供，HPLC≥98.5%，批號：23180-57-6。將芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品溶于PBS中配成10 mM的母液，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?，實驗時用腦片培養(yǎng)液配成所需濃度。

2實驗方法

2.1腦片制備及培養(yǎng)在 Stoppini法［6］的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，取新生7～9 d的SD大鼠，75%酒精擦拭消毒后立即斷頭取腦，迅速置于0～4℃MEM中，洗盡殘留血液與組織液后迅速在解剖顯微鏡下剝離軟腦膜。以大鼠腦離體定位圖譜為參照，冠狀面切除小腦及以下區(qū)域，并沿大腦中線以矢狀面將大腦一切為二。在切片機(jī)載物臺上滴加502膠水，迅速將半腦的冠切面置于膠水上，使腦與載物臺面相垂直。載物臺隨即放入含MEM的振動切片槽中，切片機(jī)以1 mm/s的速度冠狀面切取400μm厚且含海馬組織的腦片，并以細(xì)尖嘴鑷和軟毛刷將海馬與周圍組織分離，得到完整的海馬組織。將組織轉(zhuǎn)移至插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿（insert）中，每個insert放置3片，并用移液槍小心吸走殘留MEM，使腦片處于氣液交界面。將insert放入每孔含有1mL腦片培養(yǎng)液的六孔板中（培養(yǎng)液成分：25%HBSS+50%MEM +25%馬血清+6.5 g/L D-Glucose+25 mM HEPES，pH 7.2～7.4）。將六孔板放置于飽和濕度、37℃的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d更換1次培養(yǎng)液，培養(yǎng)14 d。

2.2分組、造模與給藥海馬腦片培養(yǎng)14 d后，倒置相差顯微鏡下挑選薄厚均勻、透光性良好、結(jié)構(gòu)完整的的海馬腦片，將其隨機(jī)分為5組，每組2個復(fù)孔，每個復(fù)孔3片腦片。① 空白對照組：不做任何處理，給予腦片培養(yǎng)液1 mL；②OGD組：吸棄腦片培養(yǎng)液后，PBS小心吹洗海馬腦片3次，以去除其中殘留的含葡萄糖的培養(yǎng)液；將有腦片insert轉(zhuǎn)移至每孔含有1 mL PBS的六孔板中，然后置于94%N2、5%CO2、1%O2、37℃的三氣培養(yǎng)箱中孵育45 min后，吸棄PBS，更換為1 mL腦片培養(yǎng)液；于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h以模擬缺血再灌注。③ 芍藥苷低劑量組：按上述方法造模后，吸棄PBS，給予含芍藥苷1μM的腦片培養(yǎng)液1 mL。④ 芍藥苷中劑量組：按上述方法造模后，吸棄PBS，給予含芍藥苷10μM的腦片培養(yǎng)液1 mL。⑤ 芍藥苷高劑量組：按上述方法造模后，吸棄PBS，給予含芍藥苷100μM的腦片培養(yǎng)液1 mL。給藥后各組腦片于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.3RT-qPCR法檢測NLRP3炎癥小體組成蛋白mRNA的表達(dá)給藥24 h后，以PBS清洗海馬腦片，采用Biozol Reagent試劑提取總 RNA。逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR反應(yīng)體系20μL，預(yù)變性條件為：95℃中變性30 s；循環(huán)反應(yīng)條件為：先在95℃中反應(yīng)10 s，然后于65℃中反應(yīng)30 s，循環(huán)40次；獲取溶解曲線：先在95℃中反應(yīng)15 s，然后于60℃中反應(yīng)60 s，最后在95℃中反應(yīng)15 s。各孔Ct值根據(jù)公式RQ= 2^（-△△Ct）計算出各組樣品中mRNA的含量：△Ct=目的基因Ct值-內(nèi)參Ct值，△△Ct=該組別△Ct 值-參考組△Ct值；所得結(jié)果取平均值，得到該組的相對mRNA含量（RQ值）。引物由美國Invitrogen生命技術(shù)公司合成，NLRP3：F：5’-CCAGACCTCCAA GACCACGACT-3’，R：5’-ATCCGCAGCCAATGAAC AGA-3’；ASC：F：5’-GCACAGCCAGAACAGAACAT -3’，R：5’-CAGAGCATCCAGCAAACCAT-3’；Caspase-1：F：5’-CGTGGAGAGAAACAAGGAGTG-3’，R：5’-TTCAGTGGTTGGCATCTGTAGTC-3’。

2.4TUNEL法檢測海馬腦片細(xì)胞凋亡的情況給藥24 h后，嚴(yán)格按照TUNEL試劑盒說明書進(jìn)行操作，具體步驟：4%多聚甲醛溶液固定海馬腦片15 min；PBS洗滌5min；4℃透化過夜；PBS洗滌5 min；4%多聚甲醛溶液再固定5 min；PBS洗滌5 min；將帶有海馬腦片的半透膜從insert中取下，放置于載玻片上，滴入100μL平衡緩沖液，室溫平衡10 min；避光加入50μL TdT反應(yīng)混合液，并用塑料軟膜小心蓋住載玻片上的組織；37℃恒溫恒濕箱中避光孵育60 min；移去塑料軟膜，將腦片避光浸泡在SSC 中15 min以終止反應(yīng)；PBS洗滌5 min；避光加入100μL DAPI染液，反應(yīng)10 min；加入封片液，蓋上蓋玻片。于激光共聚焦顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞和拍照。FITC表示凋亡細(xì)胞數(shù)，DAPI表示細(xì)胞總數(shù)，按照公式計算細(xì)胞凋亡率：細(xì)胞凋亡率=［（凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%］。

3結(jié)果

3.1芍藥苷對NLRP3炎癥小體組成蛋白mRNA表達(dá)的影響表1和圖1～圖3所示，與空白對照組相比，OGD組海馬腦片中NLRP3、ASC、Caspase-1的mRNA表達(dá)量明顯增多（P＜0.01）；而芍藥苷各濃度組干預(yù)后海馬腦片中的NLRP3、ASC、Caspase-1的mRNA表達(dá)量均較OGD組明顯減少（P＜0.01）。

表1　芍藥苷對OGD海馬腦片中NLRP3炎癥小體組成蛋白m RNA表達(dá)的影響（±s）

表1　芍藥苷對OGD海馬腦片中NLRP3炎癥小體組成蛋白m RNA表達(dá)的影響（±s）

注：與空白對照組比較，1）P＜0.01；與OGD組比較，2）P＜0.01。

組別空白對照組OGD　　組芍藥苷低劑量組芍藥苷中劑量組芍藥苷高劑量組NLRP3mRNA相對RQ值1.00±0.00 3.56±0.021）3.12±0.072）1.57±0.052）1.09±0.052）ASCmRNA相對RQ值1.00±0.00 2.20±0.031）1.65±0.022）1.36±0.022）1.12±0.052）Caspase-1mRNA相對RQ值1.00±0.00 2.69±0.031）1.47±0.032）1.03±0.022）0.95±0.032）

3.2芍藥苷對細(xì)胞凋亡情況由表2和圖4所示，與空白對照組相比，OGD組的凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞凋亡率明顯增高（P＜0.01）；芍藥苷各濃度組的海馬腦片的凋亡細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞凋亡率均明顯低于OGD組（P＜0.01）。

表2　芍藥苷對OGD海馬腦片中細(xì)胞凋亡的影響（±s）

表2　芍藥苷對OGD海馬腦片中細(xì)胞凋亡的影響（±s）

注：與空白對照組比較，1）P＜0.01；與OGD組比較，2）P＜0.01。

組別空白對照組OGD　　組芍藥苷低劑量組芍藥苷中劑量組芍藥苷高劑量組凋亡率/% 3.49±0.38 52.29±2.671）37.18±1.022）27.71±1.842）17.35±1.222）

4討論

4.1在正常的生理條件下，為了維持正常的神經(jīng)功能，腦組織需要持續(xù)性的血流以獲取足夠的葡萄糖和氧氣。在缺血性腦中風(fēng)發(fā)生時，必要的血流量下降到極低的水平，腦組織的葡萄糖和氧氣供給嚴(yán)重不足，從而在缺血區(qū)產(chǎn)生不斷惡化的缺血核，引起缺血核心區(qū)的神經(jīng)元死亡以壞死為主，由此而導(dǎo)致的神經(jīng)功能缺損，是一個不可逆的過程［7］。而缺血周邊半暗帶區(qū)細(xì)胞損傷的主要形式為凋亡［8］，細(xì)胞凋亡是基因控制的細(xì)胞程序性死亡，與梗塞灶的發(fā)展擴(kuò)大關(guān)系密切。缺血神經(jīng)元凋亡具有延遲性，且呈可逆過程，這就為腦缺血的治療提供了時間，用藥物減輕神經(jīng)元的損傷進(jìn)而減少腦梗塞范圍成為可能［9］。本研究采用的OGD模型可用于模擬缺血性腦中風(fēng)過程中缺氧缺糖的環(huán)境，是一個可用于研究神經(jīng)保護(hù)機(jī)制的可靠模型［10］。

近年來，越來越多的研究表明：NLRP3炎癥小體的激活在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要的作用。NLRP3炎癥小體是一組復(fù)雜的多蛋白復(fù)合體，屬于胞質(zhì)內(nèi)模式識別受體，由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC）、Caspase-1三種胞質(zhì)成分組成。NLRP3是NOD樣受體家族成員之一，可由外源性微生物及其毒素和內(nèi)源性危險信號（如缺血再灌注損傷）激活，其通過N端熱蛋白結(jié)構(gòu)域（pyrin domain，PYD）與下游 ASC蛋白的PYD區(qū)域進(jìn)行交聯(lián)，從而允許ASC暴露出的CARD區(qū)域與C aspase-1前體的CARD區(qū)域結(jié)合，從而促進(jìn)Caspase-1前體的自我剪切，激活C aspase-1。而C aspase-1的多樣化效應(yīng)可介導(dǎo)腦缺血神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡，由此形成了NLRP3/ASC/ C aspase-1級聯(lián)反應(yīng)通路［11］。

4.2先前已有報道證實芍藥苷能迅速透過血腦屏障并到達(dá)海馬組織［12］，且有研究通過 PI染色法證實芍藥苷在炎癥誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷過程中具有神經(jīng)保護(hù)作用［13］。本研究結(jié)果顯示：海馬腦片OGD后NLRP3炎癥小體組成蛋白（NLRP3、ASC、Caspase-1）的mRNA表達(dá)量和細(xì)胞凋亡率均明顯高于空白對照組（P＜0.01），提示海馬腦片在OGD 45 min后NLRP3炎癥小體被大量激活，從而通過級聯(lián)反應(yīng)引起細(xì)胞凋亡。給予1μM、10μM和 100μM濃度的芍藥苷干預(yù)24 h后，NLRP3、ASC、Caspase-1的mRNA表達(dá)量和細(xì)胞凋亡率較OGD組均明顯減少（P＜0.01），提示芍藥苷對OGD損傷的海馬腦片具有抗細(xì)胞凋亡的作用，其作用可能與下調(diào)OGD海馬腦片中NLRP3炎癥小體組成蛋白的表達(dá)有關(guān)。

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R285.5

A

1000-338X（2016）02-0025-04

2016-02-10

福建省衛(wèi)生和計劃生育委員會資助課題（WZZY201302）；福建省教育廳課題（JA15245）；福建中醫(yī)藥大學(xué)校管課題（X2014143）

何一博（1990—），男，2013級藥理學(xué)專業(yè)碩士研究生，主要從事中藥神經(jīng)藥理研究。

黃枚（1966—），女，教授。E-mail：hmei0303@qq.com