盧焯明，張春紅，杜廣亮，陳致雯（廣州市中醫(yī)醫(yī)院，廣東 廣州510130）

·臨床研究·

補(bǔ)氣益精生血法治療β地中海貧血11例及對(duì)BCL11A影響

盧焯明，張春紅，杜廣亮，陳致雯
（廣州市中醫(yī)醫(yī)院，廣東 廣州510130）

目的觀察補(bǔ)氣益精生血方藥對(duì)中間型β地中海貧血（β地貧）患兒療效及對(duì)關(guān)鍵紅系反式作用因子的影響。方法采用隨機(jī)對(duì)照雙盲雙模法將入選的β地貧患兒24例分為中藥組11例及對(duì)照組10例，中藥組口服黃芪、黨參、龜板、當(dāng)歸顆粒及安慰劑片，對(duì)照組口服羥基脲片及安慰劑顆粒，療程12周。觀察2組血常規(guī)及胎兒血紅蛋白（HbF）比例等指標(biāo)，并以實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)檢測(cè)BCL11A基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。結(jié)果治療后中藥組血紅蛋白值為（8.90±1.57）g/dL，對(duì)照組為（9.06±1.73）g/dL，2組比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但2組治療后HbF均較治療前有顯著提升（P均＜0.01）。中藥組能顯著下調(diào)BCL11A基因表達(dá)水平，由治療前（0.34± 0.11）copies下降至（0.18±0.13）copies（P＜0.05），下調(diào)程度亦優(yōu)于對(duì)照組（P＜0.01）。結(jié)論補(bǔ)氣益精生血法治療小兒β地貧具有較好療效，其分子機(jī)制可能與抑制BCL11A從而誘導(dǎo)胎兒血紅蛋白生成有關(guān)。

β地中海貧血；胎兒血紅蛋白；BCL11A；中醫(yī)藥療法

地中海貧血（下稱(chēng)地貧）是在我國(guó)南方常見(jiàn)的嚴(yán)重危害兒童青少年健康的一種遺傳性溶血性貧血疾病，很多患兒需要依賴(lài)輸血及長(zhǎng)期去鐵治療。但兩種治療手段存在著內(nèi)皮損傷、傳染病暴露等毒副作用，也給患兒家庭帶來(lái)了較大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1-2］。至于治療重型地貧的骨髓移植，由于骨髓來(lái)源少、費(fèi)用高昂等因素只有少部分病人能惠及［3］。β地貧另一可選的治療手段為珠蛋白基因誘導(dǎo)，即通過(guò)藥物來(lái)誘導(dǎo)γ珠蛋白基因高表達(dá)以合成胎兒血紅蛋白（fetal hemoglobin，HbF），在代償正常血紅蛋白不足的同時(shí)也可以結(jié)合β地貧患兒血中過(guò)多的α鏈從而減輕溶血［4-5］。以羥基脲為代表的各種誘導(dǎo)西藥有一定療效，但其骨髓抑制、免疫抑制及潛在可能致癌等毒副作用，使它們的臨床應(yīng)用受到限制［6］。傳統(tǒng)中醫(yī)藥相對(duì)毒副作用較小，本課題組既往的地貧中醫(yī)證候規(guī)律研究［7-8］總結(jié)出β地貧的核心治法——補(bǔ)氣益精生血，同時(shí)我們通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)又篩選出補(bǔ)氣益精生血的中藥龜板、黃芪、黨參等能誘導(dǎo)人類(lèi)紅系細(xì)胞株表達(dá)γ珠蛋白基因并合成HbF［9-11］。后續(xù)臨床研究進(jìn)一步證明了補(bǔ)氣益精生血中藥的良好療效［12-13］，但具體分子機(jī)制有待繼續(xù)深入探討。反式作用因子B細(xì)胞淋巴瘤11A蛋白（B cell lymphoma 11A，BCL11A）新近發(fā)現(xiàn)是影響到β及γ珠蛋白基因表達(dá)最關(guān)鍵的紅系反式作用因子之一［14］。本研究運(yùn)用龜板、黃芪、黨參加當(dāng)歸的補(bǔ)氣益精生血改良配方治療β地貧患兒，檢測(cè)血液學(xué)指標(biāo)以觀察療效，并與羥基脲片治療進(jìn)行隨機(jī)雙盲對(duì)照，同時(shí)對(duì)用藥后體內(nèi)BCL11A基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析，從BCL11A基因角度探討中藥起效的分子機(jī)制。

1對(duì)象與方法

1.1一般資料本研究得到我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，共納入了2015年6月—2016年1月在廣州市中醫(yī)醫(yī)院就診的中間型β地貧患兒24例，均得到本人或監(jiān)護(hù)人的知情同意。對(duì)符合以下標(biāo)準(zhǔn)的β地貧患兒使用SPSS13.0軟件隨機(jī)數(shù)字生成器按1∶1的比例完全隨機(jī)分配進(jìn)入中藥組及對(duì)照組各12例（研究過(guò)程中藥組脫落1例，對(duì)照組脫落2例）。2組年齡、性別、病程比較，差異無(wú)顯著性（P＞0.05），具有可比性，見(jiàn)表1。

表1　2組一般資料比較（±s）

表1　2組一般資料比較（±s）

組別中藥組對(duì)照組n 12 12 男65 女67年齡/歲6.59±4.30 7.12±3.88

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》［15］中間型β地貧診斷標(biāo)準(zhǔn)，① 臨床表現(xiàn)：多在2～5歲時(shí)出現(xiàn)貧血，癥狀和體征較重型輕，可有地中海貧血面容。② 實(shí)驗(yàn)室檢查：血紅蛋白60～100 g/L （6～10 g/dL），成熟紅細(xì)胞形態(tài)與重型相似，網(wǎng)織紅細(xì)胞增多，可見(jiàn)有核紅細(xì)胞，HbF＞3.5%。③ 遺傳學(xué)：父母均為β珠蛋白生成障礙性貧血。符合上述條件者可作出臨床診斷，進(jìn)一步診斷需進(jìn)行基因分析。

1.3中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)筆者課題組既往的β地貧中醫(yī)證候規(guī)律研究［7-8］，并參照《中醫(yī)證候鑒別診斷學(xué)》［16］及《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》［17］相關(guān)內(nèi)容，制定如下辨證標(biāo)準(zhǔn)。氣血不足的四診癥狀：①面色淡白或萎黃；② 唇甲色淡；③ 神疲乏力；④ 易受外感；⑤ 自汗；⑥ 脈細(xì)弱。腎精虧虛的四診癥狀：① 發(fā)育落后；② 筋骨痿弱；③ 頭暈?zāi)垦?；?易口干；⑤ 少苔；⑥脈沉細(xì)。辨證由課題組2名中醫(yī)師通過(guò)四診來(lái)共同判別，凡符合氣血不足及腎精虧虛四診癥狀各3條或以上，即辨證為氣血不足、腎精虧虛證。

1.4納入標(biāo)準(zhǔn)①年齡2～18歲；②基因分析已確診為β地中海貧血，符合以上診斷標(biāo)準(zhǔn)及中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)；③ 血紅蛋白（hemoglobin，Hb）≥60 g/L。

1.5排除標(biāo)準(zhǔn)① 有心、肝、腎、內(nèi)分泌等系統(tǒng)疾患及其他原發(fā)性血液病者；② 近12周內(nèi)曾輸血或服用任何抗貧血藥物；③ 過(guò)敏體質(zhì)者；④ 有精神疾病不合作或依從性差者。

1.6治療方法為克服研究者的主觀偏倚、參與研究的患者心理因素干擾及中西藥劑型的差異，研究采用雙盲雙模擬法。中藥組口服中藥配方顆粒（廣東一方制藥有限公司），包括黃芪顆粒、黨參顆粒、龜甲顆粒、當(dāng)歸顆粒，每袋均為飲片10 g的水提取物。用法與用量：2～6歲各1袋，6～12歲各2袋，12～18歲各3袋；均每日1次，混合后以溫開(kāi)水沖服。同時(shí)加用西藥安慰劑，依據(jù)安慰劑制備規(guī)范采用糊精制備，外觀性狀與羥基脲片相似，用法同對(duì)照組。

對(duì)照組口服羥基脲片（齊魯制藥有限公司），按10 mg/（kg/d）用量，每周連用4 d，停藥3 d。同時(shí)加用中藥安慰劑，中藥安慰劑用糊精制備，外觀性狀與中藥配方顆粒相似，用法用量參照中藥組。2組療程均為12周，由掌握隨機(jī)分組的第三方專(zhuān)人發(fā)藥。治療期間不輸血或使用其他影響血液系統(tǒng)的藥物。

1.7觀察指標(biāo)

1.7.1血液學(xué)指標(biāo)治療前及治療后每4周直至12周，分別取患兒末梢血以全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)血常規(guī)，觀察血紅蛋白（Hb）、紅細(xì)胞總數(shù)（RBC）、紅細(xì)胞平均體積（MCV）、平均血紅蛋白含量（MCH）；治療前及治療12周后分別取患兒靜脈血以手工計(jì)算網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（Ret）；采用堿性血紅蛋白電泳法檢測(cè)HbF比例；采用比色法檢測(cè)紅細(xì)胞滲透脆性。

1.7.2安全性指標(biāo)同上檢測(cè)血常規(guī)方法，觀察白細(xì)胞總數(shù)（WBC）、中性粒細(xì)胞總數(shù)（NEU）、血小板總數(shù)（PLT）；治療前及治療12周后分別取患兒靜脈血以全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行肝功能測(cè)定，觀察血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、谷氨酸?；D(zhuǎn)移酶（GGT））以及腎功能測(cè)定包括血清尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）。

1.7.3BCL11A基因表達(dá)水平以實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)BCL11A基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平：治療開(kāi)始前及治療12周后分別取患兒靜脈血，采用不連續(xù)密度梯度離心法分離包含有核紅細(xì)胞在內(nèi)的單個(gè)核細(xì)胞。根據(jù)BCL11A基因序列設(shè)計(jì)并合成引物，用Trizol提取總RNA。使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，之后使用熒光染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線、各樣本BCL11A基因的Ct值并以?xún)?nèi)參照基因矯正，得出目的基因mRNA水平相對(duì)的拷貝數(shù)。每樣本的PCR實(shí)驗(yàn)使用復(fù)孔3次，取均值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)錄入SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料屬正態(tài)分布以±s表示，同組治療前后差異采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析及配對(duì)t檢驗(yàn)，組間差異采用成組t檢驗(yàn)及協(xié)方差分析。

2結(jié)果

2.12組血常規(guī)指標(biāo)變化比較見(jiàn)表2。

表2　2組血常規(guī)指標(biāo)變化比較（±s）

表2　2組血常規(guī)指標(biāo)變化比較（±s）

注：與治療前比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01。

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2.22組HbF比例、Ret及紅細(xì)胞滲透脆性變化比較見(jiàn)表3。

2.32組治療前后WBC、NEU、PLT變化比較見(jiàn)表4。

2.42組BCL11A基因表達(dá)水平變化比較見(jiàn)表5。

2.52組治療前后肝腎功能變化情況2組ALT、AST、GGT、BUN及Cr的組間差異及治療前后的差異均無(wú)顯著性（P＞0.05）。

表3　2組HbF比例、Ret及紅細(xì)胞滲透脆性變化比較（±s）

表3　2組HbF比例、Ret及紅細(xì)胞滲透脆性變化比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，1）P＜0.05；與治療前比較，2）P＜0.01。

組別中藥組n 11對(duì)照組治療前治療后治療前治療后10 HbF比例/% 61.15±23.81 72.54±24.832）63.08±30.65 76.50±33.122）Ret 0.032±0.013 0.037±0.0121）0.036±0.017 0.019±0.0132）紅細(xì)胞滲透脆性/% 62.35±20.10 67.58±18.82 66.45±18.13 73.40±22.63

表4　2組治療前后WBC、NEU、PLT變化比較（±s）　×109/L

表4　2組治療前后WBC、NEU、PLT變化比較（±s）　×109/L

注：與對(duì)照組比較，1）P＜0.05；與治療前比較，2）P＜0.05。

組別中藥組n 11對(duì)照組治療前治療后治療前治療后10 WBC 8.35±3.02 8.56±2.111）7.97±2.39 5.30±1.282）NEU 3.18±2.66 3.62±1.201）3.06±2.11 1.93±1.052）PLT 353.00±165.66 348.51±155.81 317.00±156.40 193.50±140.63

表5　2組BCL11A基因表達(dá)水平變化比較（±s）copies

表5　2組BCL11A基因表達(dá)水平變化比較（±s）copies

注：與對(duì)照組比較，1）P＜0.01；與治療前比較，2）P＜0.05。

組別中藥組對(duì)照組n 11 10治療前0.34±0.11 0.31±0.13治療后0.18±0.131）2）0.33±0.20

3討論

為了得到更客觀可靠的證據(jù)，本研究在課題組既往研究［9-13］的基礎(chǔ)上改用中藥與誘導(dǎo)西藥的陽(yáng)性代表藥物羥基脲作對(duì)照，進(jìn)行了雙盲雙模擬的隨機(jī)對(duì)照研究。地貧患兒的Hb需維持在一定水平才能保證其生長(zhǎng)發(fā)育，因而一般把Hb作為評(píng)價(jià)療效的最主要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示中藥及羥基脲治療后均可顯著提升Hb水平，提示補(bǔ)氣益精生血方藥對(duì)兒童中間型β地貧是有一定療效的。但如果是針對(duì)羥基脲的優(yōu)效檢驗(yàn)，本研究樣本量明顯不足，有待今后擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步深入考察。

本研究顯示中藥也能提升患兒RBC水平，而RBC上升可能是骨髓造血功能的提升，也可能是外周血中紅細(xì)胞破壞的減少。本研究同時(shí)顯示中藥能一定程度上提升患兒的網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)，提示中藥有可能刺激了患兒的骨髓造血。至于羥基脲組RBC及網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)在治療后均有下降，可能與羥基脲抑制骨髓的毒副作用有關(guān)。另外，中藥及羥基脲對(duì)患兒的紅細(xì)胞脆性似乎也有輕度改善作用，但確切效果未明。后續(xù)我們運(yùn)用堿性血紅蛋白電泳法檢測(cè)了HbF水平，結(jié)果提示中藥及羥基脲均可誘導(dǎo)γ珠蛋白基因表達(dá)從而合成HbF，此結(jié)果也進(jìn)一步提示2組Hb水平的提升主要來(lái)源于HbF而不是HbA，而2組紅細(xì)胞脆性的改善也可能與γ珠蛋白基因表達(dá)合成γ鏈再結(jié)合α鏈生成HbF（α2γ2），從而減少了α鏈四聚體引起的溶血有關(guān)。

對(duì)于誘導(dǎo)γ珠蛋白基因表達(dá)合成HbF的分子機(jī)制，本研究從關(guān)鍵紅系反式作用因子角度作了進(jìn)一步分析。反式作用因子BCL11A在沉默γ珠蛋白基因及血紅蛋白發(fā)育轉(zhuǎn)換中的重要作用是近年國(guó)際血液學(xué)研究的重大發(fā)現(xiàn)之一，相關(guān)研究論文相繼發(fā)表在《Science》、《Nature》等頂級(jí)學(xué)術(shù)期刊上［14，18］。我們運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)用藥前后BCL11A基因的mRNA水平，結(jié)果提示中藥可顯著抑制BCL11A基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而羥基脲則無(wú)明顯作用。至于中藥對(duì)BCL11A基因在翻譯表達(dá)水平的影響，能否真正減少BCL11A的蛋白含量，有待后續(xù)western blot等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)。

BCL11A對(duì)γ珠蛋白的抑制與它對(duì)β-LCR上的HS3、γ珠蛋白基因啟動(dòng)子以及γ-δ基因間區(qū)域等作用有關(guān)，BCL11A沉默或缺失可使γ珠蛋白基因表達(dá)抑制得到解除從而提升HbF［18-21］。某些西藥如泊馬度胺［22］、細(xì)胞因子類(lèi)藥物［23］對(duì)γ珠蛋白的誘導(dǎo)即與其抑制BCL11A有關(guān)。另有體外研究發(fā)現(xiàn)：存在于葡萄皮及紅酒中的天然物質(zhì)白藜蘆醇能通過(guò)抑制細(xì)胞株BCL11A從而誘導(dǎo)γ珠蛋白及HbF［24］。目前尚未見(jiàn)中藥對(duì)BCL11A影響的研究報(bào)道，本研究首次從關(guān)鍵紅系反式作用因子BCL11A的前沿角度探討了中藥治療β地貧的分子機(jī)制，具有一定的創(chuàng)新性。

在與其他紅系轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)系方面，BCL11A 與 SOX6、Myb、KLF1的共表達(dá)及相互作用也是 γ珠蛋白基因沉默的重要機(jī)制［19，25，26］。以BCL11A和/ 或KLF1為靶點(diǎn)的反義寡核苷酸基因治療可有效增加γ珠蛋白的表達(dá)［27］。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)辛伐他汀與抗氧化藥物丁基氫醌均能通過(guò)同時(shí)抑制 KLF1及BCL11A表達(dá)從而誘導(dǎo)HbF［28］。作為復(fù)方中藥其起效機(jī)制常常是多靶點(diǎn)、多途徑的，今后研究也可著眼于更廣泛的多種紅系反式作用因子而不一定只局限于BCL11A，同時(shí)也可考慮從反式作用因子與順式作用元件相互作用的角度著手。

在安全性指標(biāo)方面，羥基脲治療后患兒的WBC、NEU均顯著低于中藥治療的患兒，這可能與羥基脲本身的骨髓抑制作用有關(guān)。且羥基脲在一定程度上影響患兒的免疫力，并有潛在致癌的風(fēng)險(xiǎn)性。從目前研究數(shù)據(jù)看來(lái)，補(bǔ)氣益精生血中藥具有與誘導(dǎo)西藥相近的效果，且毒副作用明顯較低，具有良好的開(kāi)發(fā)前景。目前研究為初步研究，樣本量較少，有待今后擴(kuò)大樣本量以更加明確其療效及安全性，并從更多途徑、更多角度研究其起效機(jī)制。

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R556.61

B

1000-338X（2016）02-0001-04

2016-01-20

廣東省中醫(yī)藥局科研課題（20141208）；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2015A030310311）；廣東省科學(xué)技術(shù)廳-廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院聯(lián)合科研專(zhuān)項(xiàng)（2011B032200002）。

盧焯明，男，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，主要從事兒科中西醫(yī)結(jié)合臨床研究。