黃　牛

(武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)，湖北 武漢 430071)

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姜黃素對(duì)人骨肉瘤U-2OS細(xì)胞細(xì)胞周期、凋亡及Bcl-2表達(dá)的影響

黃牛

(武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)，湖北 武漢 430071)

摘要：目的 探討姜黃素對(duì)人骨肉瘤U-2OS細(xì)胞細(xì)胞周期、凋亡及Bcl-2表達(dá)的影響。方法 采用不同濃度(10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)、不同時(shí)間(24h、48h、72h)姜黃素處理人骨肉瘤U-2OS細(xì)胞，分別采用MTT法、流式細(xì)胞儀及western blot檢測細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡及Bcl-2蛋白表達(dá)。結(jié)果 姜黃素對(duì)U-2OS細(xì)胞體外增殖具有顯著的抑制作用，并呈現(xiàn)劑量及時(shí)間依賴性。隨著姜黃素濃度及作用時(shí)間的增加，G0-G1期細(xì)胞所占比率顯著增高。姜黃素對(duì)U-2OS細(xì)胞凋亡具有顯著的促進(jìn)作用，并呈現(xiàn)劑量及時(shí)間依賴性。姜黃素處理后U-2OS細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，且其降低程度與姜黃素濃度呈正相關(guān)。結(jié)論 姜黃素可通過劑量依賴與時(shí)間依賴，促進(jìn)骨肉瘤U-2OS細(xì)胞G0-G1期阻滯，從而誘導(dǎo)骨肉瘤U-2OS細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因Bcl-2低表達(dá)是其可能作用機(jī)制。

關(guān)鍵詞：姜黃素；骨肉瘤；凋亡；細(xì)胞周期；Bcl-2

骨肉瘤是臨床常見的惡性骨腫瘤之一，好發(fā)于青少年，其對(duì)放、化療等治療方案敏感性較低，預(yù)后較差。因此，探討更有效的骨肉瘤防治措施是近年來臨床研究的熱點(diǎn)難點(diǎn)。姜黃素是由姜科黃屬植物姜黃根莖中提取的多酚類化合物，具有抗炎、抗氧化及抗腫瘤等多種生物學(xué)活性[1]。近年來研究表明，姜黃素可誘導(dǎo)多種體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞如胃癌[2]、肝癌[3]及結(jié)腸癌[4]等的凋亡，但其對(duì)人骨肉瘤的作用鮮見報(bào)道。為探討姜黃素對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞的作用，本研究采用體外培養(yǎng)方法，觀察不同濃度、不同時(shí)間姜黃素處理對(duì)人骨肉瘤U-2OS細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期及Bcl-2表達(dá)的影響，旨在為骨肉瘤的臨床治療提供可靠理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料姜黃素、MTT(Sigma公司)；人骨肉瘤U-2OS細(xì)胞株(ATCC細(xì)胞庫，美國)；胎牛血清、DEME培養(yǎng)基、PBS緩沖液、胰蛋白酶(Gibco公司)；Annexin-V-FITC凋亡試劑盒(Beckman coulter公司)；Bcl-2兔抗人多克隆抗體(Santa Cruz公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)蘇人骨肉瘤U-2OS細(xì)胞株，PBS洗滌3次，DMEM培養(yǎng)基洗滌3次，用含有10%胎牛血清、0.1g/L鏈霉素、105U/L青霉素DMEM培養(yǎng)液將細(xì)胞混勻，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液1次。收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，采用不同濃度姜黃素(10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)和不同時(shí)間(24h、48h、72h)對(duì)人骨肉瘤U-2OS細(xì)胞進(jìn)行處理。

1.3姜黃素對(duì)U-2OS細(xì)胞體外增殖抑制作用胰酶消化人骨肉瘤U-2OS細(xì)胞，PBS緩沖液洗滌3次，800rmp 離心10min，棄上清，DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/ml，將細(xì)胞加至96孔培養(yǎng)板，200μl/孔。將細(xì)胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h，加入姜黃素，終濃度分別為0μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml，每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔，共5組。細(xì)胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h、48h、72h，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，加入MTT(5mg/ml)20μl/孔，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱4h，800rmp離心10min，棄上清，加入酸化異丙醇180μl/孔，震蕩使紫色結(jié)晶溶解，酶標(biāo)儀測OD570nm吸光值。

1.4姜黃素處理后U-2OS細(xì)胞形態(tài)變化倒置顯微鏡下觀察不同濃度姜黃素處理72h后U-2OS細(xì)胞形態(tài)變化。

1.5細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期檢測采用同“方法1.3”相同方法培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)結(jié)束后，800rmp 離心10min，棄上清，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6Bcl-2蛋白表達(dá)檢測采用westernblot檢測Bcl-2蛋白表達(dá)。收集不同濃度姜黃素培養(yǎng)72h后的U-2OS細(xì)胞，提取其胞質(zhì)蛋白，行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜，5%封閉液4℃封閉4h，TBS緩沖液漂洗3次，加入Bcl-2兔抗人多克隆抗體(1∶1000)，4℃孵育過夜，TBS緩沖液漂洗3次，加入相應(yīng)二抗(1∶500)，室溫孵育2h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯色系統(tǒng)顯色。

2結(jié)果

2.1姜黃素對(duì)U-2OS細(xì)胞體外增殖抑制作用姜黃素對(duì)U-2OS細(xì)胞體外增殖具有顯著的抑制作用。在同一時(shí)間條件下，姜黃素濃度越高則U-2OS細(xì)胞增殖抑制作用越明顯(P<0.05)；在同一濃度條件下，姜黃素處理時(shí)間越長則U-2OS細(xì)胞增殖抑制作用越明顯(P<0.05)。提示姜黃素對(duì)U-2OS細(xì)胞體外增殖抑制作用呈現(xiàn)顯著的劑量依賴性和時(shí)間依賴性，見表1。

表1　不同濃度姜黃素對(duì)U-2OS細(xì)胞體外增殖抑制作用±s，n=3)

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與24h組比較，#P<0.05

2.2姜黃素處理后U-2OS細(xì)胞形態(tài)變化倒置顯微鏡下可見未經(jīng)姜黃素處理的U-2OS細(xì)胞狀態(tài)良好，折光性佳，排列緊密。隨著姜黃素處理濃度的增大，U-2OS細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，折光性差，排列疏松，附壁性減弱，且有部位細(xì)胞形態(tài)變?yōu)閳A形，偶見凋亡細(xì)胞碎片。

2.3姜黃素對(duì)U-2OS細(xì)胞周期的影響在同一時(shí)間條件下，姜黃素濃度越高則U-2OS細(xì)胞G0-G1期細(xì)胞所占比率越高，S期、G2期細(xì)胞所占比率越低(P<0.05)；在同一濃度條件下，姜黃素處理時(shí)間越長則G0-G1期細(xì)胞所占比率越高，S期、G2期細(xì)胞所占比率越低(P<0.05)。提示姜黃素可使U-2OS細(xì)胞停滯于G0-G1期，從而抑制U-2OS細(xì)胞體外增殖，并呈現(xiàn)顯著的劑量依賴性和時(shí)間依賴性，見表2。

表2　不同濃度姜黃素對(duì)U-2OS細(xì)胞周期的影響±s，n=3)

與對(duì)照組比較，*P<0.05;與24h組比較，#P<0.05

2.4姜黃素對(duì)U-2OS細(xì)胞凋亡的影響姜黃素對(duì)U-2OS細(xì)胞凋亡具有顯著的促進(jìn)作用。在同一時(shí)間條件下，姜黃素濃度越高則U-2OS細(xì)胞凋亡率越高(P<0.05)；在同一濃度條件下，姜黃素處理時(shí)間越長則U-2OS細(xì)胞凋亡率越高(P<0.05)。提示姜黃素對(duì)U-2OS細(xì)胞凋亡促進(jìn)作用呈現(xiàn)顯著的劑量依賴性和時(shí)間依賴性，見表3。

表3　不同濃度姜黃素對(duì)U-2OS細(xì)胞凋亡率的影響±s，n=3)

與對(duì)照組比較，*P<0.05;與24h組比較，#P<0.05

2.5姜黃素對(duì)U-2OS細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)的影響姜黃素處理72h后U-2OS細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，且其降低程度與姜黃素濃度呈正相關(guān)，見圖1。

圖1　姜黃素處理后U-2OS細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)

3結(jié)論

細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞為維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，在基因控制下進(jìn)行的有序性、自主性死亡。與細(xì)胞壞死的被動(dòng)過程不同，細(xì)胞凋亡是一個(gè)主動(dòng)過程，并與一系列基因的激活、表達(dá)及調(diào)控密切相關(guān)[5]。Bcl-2基因家族包括抑制細(xì)胞凋亡基因如Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W及促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因如Bax、Bcl-Xs等，該家族在調(diào)控細(xì)胞凋亡過程中具有十分重要的作用。既往研究證實(shí)[6]，Bax過表達(dá)可顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但抑制Bcl-2等抑制細(xì)胞凋亡基因的過表達(dá)可起到促進(jìn)Bax引起的細(xì)胞凋亡的作用。

姜黃素作為多效性天然活性物質(zhì)，不僅可保護(hù)機(jī)體正常細(xì)胞免受損傷，也可通過多途徑抑制腫瘤細(xì)胞增殖。肖揚(yáng)等[7]以阿霉素為誘導(dǎo)藥物，采用阿霉素大劑量沖擊法建立人骨肉瘤U-2OS細(xì)胞耐藥模型(U-2OS/ADM)，并在此基礎(chǔ)上探討姜黃素對(duì)細(xì)胞多藥耐藥性的細(xì)胞作用，結(jié)果顯示姜黃素可有效增加阿霉素對(duì)U-2OS/ADM的細(xì)胞毒作用，從而逆轉(zhuǎn)U-2OS/ADM細(xì)胞的多藥耐藥現(xiàn)象。范全等[8]采用姜黃素處理人骨肉瘤U2OS細(xì)胞，可顯著抑制細(xì)胞體外增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且其作用呈劑量依賴性，與本研究結(jié)果一致。惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展和腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡密切相關(guān)，細(xì)胞凋亡具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用，從而有效抑制腫瘤生長[9]。因此，如何誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為腫瘤治療的新方向。磷脂酰絲氨酸(PS)作為凋亡細(xì)胞表面分子充分暴露于凋亡細(xì)胞膜外，因此采用PS結(jié)合Annexin對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測是目前最理想的細(xì)胞凋亡定量檢測方法。流式細(xì)胞儀PI染色法結(jié)果顯示，姜黃素可顯著促進(jìn)U-2OS細(xì)胞凋亡，并呈現(xiàn)顯著的劑量依賴性和時(shí)間依賴性，且大多數(shù)細(xì)胞阻止于G0-G1期，這可能與姜黃素對(duì)DNA合成的抑制作用有關(guān)。采用westernblot檢測Bcl-2蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示經(jīng)姜黃素(10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)作用72h后，U-2OS細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)隨姜黃素濃度增加而顯著降低，提示姜黃素降低Bcl-2蛋白表達(dá)是其促進(jìn)U-2OS細(xì)胞凋亡的可能作用機(jī)制之一。

本研究結(jié)果顯示姜黃素對(duì)人骨肉瘤U-2OS細(xì)胞的作用呈現(xiàn)明顯的時(shí)間和濃度依賴性，所以隨濃度升高，作用越強(qiáng)。若今后在臨床應(yīng)用過程中，姜黃素可能會(huì)對(duì)人體其他正常細(xì)胞產(chǎn)生一系列作用，再研究其最佳濃度。姜黃素作為潛在的治療骨肉瘤(尤其是對(duì)化療藥物多藥耐藥性骨肉瘤)的化療藥物，其作用機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。

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Effect of Curcumin on Cell Cycle，Apoptosis and Bcl-2 Expression in Human Osteosarcoma U-2OS Cells

HUANG Niu

(DepartmentofbasicMedicalSciences，WuhanUniversity，WuhanHubei430071，China)

ABSTRACT：Objective To evaluate the effect of curcumin on cell cycle，apoptosis and Bcl-2 expression in human osteosarcoma U-2OS cells. Methods U-2OS cells were treated with different time(24h，48h or 72h)and different concentrations(10μg/ml，50μg/ml，100μg/ml or 200μg/ml)of curcumin.The cell proliferation，apoptosis and the Bcl-2 protein expressionwere determined by MTT method，flow cytometry and western blot，respectively.Results A time-dependent and dose-dependent growth inhibition of U-2OS cells was shown after exposure to curcumin.With the increase of curcumin concentration and action time，proportion of G0-G1 phase cells was increased significantly，，the Bcl-2 protein expression was obviously reduced，and was positively correlated with the concentration of curcumin.Conclusion Curcumin can induce apoptosis of human osteosarcoma U-2OS cells through the initiation of G0-G1 phase arrest and inhibiting mitosis in dose-dependent and time-dependent manner.Down-regulation of Bcl-2 gene may be the mechanism of apoptosis.

KEY WORDS：Curcumin；Osteosarcoma；Apoptosis；Cell cycle;Bcl-2

(收稿日期：2016-01-03)

DOI:10.16751/j.cnki.2095-4646.2016.02.099

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：2095-4646(2016)02-099-04