黃　娟，劉秀芬，2，余紅蕾，王立瓊，程首超，程學(xué)文，趙紅玲**

(1.咸寧市中心醫(yī)院兒內(nèi)科，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學(xué)院)

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低分子柑桔果膠粉對(duì)哮喘小鼠Th1/Th2平衡及核因子NF-κB表達(dá)的影響*

黃娟1，劉秀芬1，2，余紅蕾1，王立瓊1，程首超1，程學(xué)文1，趙紅玲1**

(1.咸寧市中心醫(yī)院兒內(nèi)科，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學(xué)院)

摘要：目的 探討核因子-κB(NF-κB)和Th1/Th2免疫失衡在哮喘小鼠模型中的作用及低分子柑桔果膠粉防治的機(jī)制。方法 用卵清白蛋白(OVA)建立哮喘模型。BALB/c小鼠隨機(jī)分為四組：正常對(duì)照組、哮喘組、低分子柑桔果膠治療組、地塞米松治療組，每組10只。留取支氣管肺泡灌洗液(BALF)進(jìn)行細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)和分類計(jì)數(shù)；應(yīng)用ELISA法檢測(cè)BALF中IL-4、IFN-γ濃度，采用免疫組化檢測(cè)NF-κB的表達(dá)。結(jié)果 低分子柑桔果膠粉治療組血和BALF中IL-4的含量明顯低于哮喘組(P<0.05)； 低分子柑桔果膠粉治療組哮喘小鼠肺組織中NF-κB陽性細(xì)胞百分比顯著低于哮喘組(P<0.05)； 哮喘小鼠肺組織中NF-κB表達(dá)與BLAF中的IL-4濃度成顯著正相關(guān)(P<0.05)，而與BLAF中的IFN-γ濃度成顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。結(jié)論 低分子柑桔果膠粉能降低支氣管哮喘小鼠血清及BALF中炎癥因子IL-4的濃度，減輕支氣管哮喘模型小鼠肺組織病理損害,可能的機(jī)制是調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡及抑制NF-κB激活,減少氣道上皮的NF-κB表達(dá),從而阻止哮喘的發(fā)生發(fā)展。

關(guān)鍵詞：低分子柑桔果膠粉(MCP)；哮喘；NF-κB；IL-4；IFN-γ；Th1/Th2平衡

低分子柑桔果膠(MCP)是從天然產(chǎn)物柑桔中經(jīng)過特殊技術(shù)提取得到的一種以半乳糖為主要成份的多糖。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MCP有直接增強(qiáng)免疫功能的作用，可糾正炎癥中Th1/Th2 失衡，調(diào)節(jié)CD4+/ CD8+細(xì)胞的比例，增強(qiáng)單核細(xì)胞細(xì)胞毒作用及巨噬細(xì)胞的吞噬功能[1]。國(guó)外已經(jīng)廣泛用于腫瘤的研究和治療[2]，但國(guó)內(nèi)外尚無其用于哮喘治療的研究報(bào)道。本文將探討MCP粉對(duì)哮喘小鼠Th1/Th2失衡及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的調(diào)節(jié)作用。

1材料與方法

1.1小鼠哮喘模型的建立及劑量設(shè)計(jì)SPF級(jí)BALB/c雄性小鼠40只(由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供)，體重14～18g，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(A組)，哮喘組(B組)，低分子柑桔果膠治療組(C組)，地塞米松治療組(D組),每組10只。采用V級(jí)OVA制備模型，哮喘模型的制作參照文獻(xiàn)[3]的方法略作改進(jìn)，分致敏、激發(fā)兩個(gè)階段，方法如下：于第8d和第21d腹腔注射0.1ml含1%OVA的Al(OH)3凝膠致敏，各一次，共2次，第32d開始使用空氣壓縮霧化器向置于密閉有機(jī)玻璃容器內(nèi)的小鼠噴霧1%OVA，每天吸入30min，連續(xù)定時(shí)激發(fā)1周。C組于激發(fā)前每天8:30按2400mg/kg灌胃低分子柑桔果膠。D組于每次激發(fā)前1h按0.5mg/kg腹腔注射地塞米松液。A組以生理鹽水代替OVA致敏和激發(fā)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)用品說明，成人服用MCP粉的劑量為80mg/(kg·d)，因動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的最高劑量為人類劑量的30倍，所以設(shè)計(jì)MCP劑量為2400mg/(kg·d)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法各組末次激發(fā)24h內(nèi)處死，眼球動(dòng)脈取血，收集血清，肺組織進(jìn)行支氣管肺泡灌洗并留取支氣管肺泡灌洗液(BALF)經(jīng)2000rpm離心15min，取上清液檢測(cè)IFN-γ和IL-4濃度。支氣管肺泡灌洗小鼠收取BALF，細(xì)胞分類計(jì)數(shù)使用瑞士染色。BALF沉渣用1mlPBS液重懸，取200μl滴于玻片上自然晾干備用，余用槍頭抽取100μl至細(xì)胞計(jì)數(shù)板，用低倍鏡計(jì)數(shù)四角的四大方格中白細(xì)胞總數(shù)。按下式計(jì)算小鼠細(xì)胞總數(shù)：白細(xì)胞數(shù)/L=(四大方格內(nèi)白細(xì)胞總數(shù)*107)/4。BALF沉渣涂片待自然晾干后，加瑞氏液2～4滴，固定0.5～1min，再加等量緩沖液與染料混勻，染色5～10min，用自來水沖去染液。選擇涂片體尾交界處染色良好區(qū)域，在高倍鏡下，按一定順序移動(dòng)視野，根據(jù)形態(tài)特征對(duì)200個(gè)白細(xì)胞，按嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)、淋巴細(xì)胞(Lym)、巨噬細(xì)胞(Mφ)、以及中性粒細(xì)胞(Neu)作細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，所有計(jì)數(shù)均由一個(gè)研究者完成，采用單盲法。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法測(cè)定BALF中IFN-γ、IL-4濃度，免疫組化SP法測(cè)肺組織中NF-κB活化值，測(cè)定方法按試劑說明書進(jìn)行操作。

2結(jié)果

2.1HE染色觀察B組小鼠肺組織切片HE染色可見肺內(nèi)支氣管粘膜下、肺內(nèi)支氣管及血管周圍較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以EOS、Lym、Neu為主，粘膜下水腫，粘液腺增生，氣道上皮多處斷裂和上皮細(xì)胞的脫落，肺間質(zhì)和支氣管腔內(nèi)可見炎性細(xì)胞滲出和分泌物，支氣管壁略顯增厚和基底膜輕度增厚且不規(guī)則，細(xì)支氣管平滑肌輕度肥大。C組和D組小鼠肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變較B組明顯減輕。見圖1(封二)。

2.2PAS染色觀察A組小鼠肺組織切片PAS染色未見黏液分泌；B組PAS染色可見氣道上皮杯狀細(xì)胞增生肥大，大量黏液形成黏液栓；C組和D組肺組織PAS染色與B組相比杯狀細(xì)胞增生不明顯，黏液分泌明顯減少。見圖2(封二)。

2.3電鏡觀察A組小鼠顯示正常肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞，支氣管纖毛上皮細(xì)胞纖毛排列齊整，肺泡隔結(jié)構(gòu)正常，表面微絨毛豐富；未見淋巴細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞附壁及浸潤(rùn)；肺細(xì)小動(dòng)脈內(nèi)膜、中膜、外膜清晰，內(nèi)皮細(xì)胞扁平，平滑肌細(xì)胞之間有散在的膠原纖維，見圖3(A)。B組小鼠電鏡觀察顯示肺間質(zhì)有EOS浸潤(rùn)，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞水腫，核輕度固縮，胞漿部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，表面微絨毛部分脫落，線粒體輕度腫脹。支氣管纖毛上皮細(xì)胞纖毛排列稀疏，有斷裂、融合現(xiàn)象；肺泡腔及血管壁有多個(gè)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn),見圖3(B)。C組程度較B組有所減輕，D組可見肺泡Ⅱ型細(xì)胞結(jié)構(gòu)接近正常，炎癥細(xì)胞明顯減少，見圖3(C、D)。

圖3　小鼠肺組織電鏡圖(×10000)

A組正常肺泡隔結(jié)構(gòu)。B組顯示內(nèi)皮細(xì)胞受損，線粒體空泡形成(黑色箭頭所示)。C組和D組細(xì)胞結(jié)構(gòu)較B組完整，炎癥細(xì)胞減少

2.4各組小鼠BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)與分類計(jì)數(shù)的比較結(jié)果顯示B組BALF中細(xì)胞總數(shù)、EOS百分比均顯著高于A組(P<0.01)，C組BALF中細(xì)胞總數(shù)、EOS百分比低于B組(P<0.01或P<0.05)，但仍顯著高于A組(P<0.01)。見表1。

表1　各組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)和分類計(jì)數(shù)±s)

與A組比較，*P<0.01；與B組比較，#P<0.05、##P<0.01

注：實(shí)驗(yàn)中因技術(shù)原因標(biāo)本不合格，故小鼠數(shù)量與原來每組數(shù)量不同(下同)

2.5各組小鼠BALF中IL-4和IFN-γ濃度的變化根據(jù)系列稀釋500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml、15.6pg/ml、7.8pg/ml、0pg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品獲得的OD值，繪制濃度一光密度標(biāo)準(zhǔn)曲線，以此標(biāo)準(zhǔn)曲線為標(biāo)準(zhǔn)，將待測(cè)標(biāo)本在自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)得的OD值轉(zhuǎn)換成IL-4濃度值和IFN-γ濃度值。BALF中IL-4濃度B組明顯高于A組、D組(P<0.01)。IFN-γ濃度B組顯著低于A組(P<0.01)，C組比B組高，但無顯著差別(P>0.05)。見表2。

表2　各組小鼠血清、BALF中IL-4濃度的變化

與A組比較，*P<0.05、**P<0.01；與B組比較，#P<0.05、##P<0.01

2.6各組小鼠血清中IL-4濃度變化和肺組織NF-κB活化的比較根據(jù)系列稀釋500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml、15.6pg/ml、7.8pg/ml、0pg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品獲得的OD值，繪制濃度一光密度標(biāo)準(zhǔn)曲線，以此標(biāo)準(zhǔn)曲線為標(biāo)準(zhǔn)，將待測(cè)血清在自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)得的OD值轉(zhuǎn)換成IL-4濃度值。血清中IL-4濃度B組高于A組(P<0.01)，C組血清中IL-4濃度明顯比B組低(P<0.01)。但是D組與B組比較差異無顯著性(P>0.05)。NF-κB主要表達(dá)于支氣管上皮細(xì)胞胞漿及核內(nèi)，支氣管上皮細(xì)胞胞核、間質(zhì)炎性細(xì)胞核可見棕黃色顆粒，為NF-κB免疫陽性蛋白，以核陽性染色的細(xì)胞比例作為NF-κB的活化值。B組NF-κB核陽性染色細(xì)胞最多，明顯多于A組(P<0.01)其余三組呈不同程度的升高，介于A組和B組之間(P<0.05或P<0.01)。相關(guān)性分析顯示小鼠肺組織中NF-κB的表達(dá)與血清中IL-4濃度(r=0.806,P<0.01)成正相關(guān)。見表3。

表3　各組小鼠血清中IL-4濃度變化及肺組織NF-κB活化的比較±s)

與A組比較，*P<0.05、**P<0.01；與B組比較，#P<0.05、##P<0.01

3討論

既往的研究證明眾所周知，Th1/Th2的免疫失衡及其功能紊亂在哮喘的發(fā)病機(jī)制中起著十分重要的作用，哮喘患者均存在Th1/Th2失衡。免疫學(xué)上一般將IFN-γ和IL-4分別作為Th1和Th2細(xì)胞的特征性細(xì)胞因子。通過檢測(cè)這兩個(gè)細(xì)胞因子可以反映出Th1/Th2的極化狀態(tài)，判斷其失衡程度。而通過糾正Th亞群的失衡來實(shí)現(xiàn)對(duì)哮喘的治療，是治療哮喘有效的途徑。

MCP基本分子結(jié)構(gòu)是半乳糖醛酸，以α-1，4糖苷鍵聚合形成的聚半乳糖醛酸酶。分子量在一萬到二萬之間，由于其分子量小，無抗原性，無毒性，水溶性好，容易被胃腸道吸收而進(jìn)入血液系統(tǒng)發(fā)揮作用，對(duì)機(jī)體的特異性和非特異性免疫產(chǎn)生影響。MCP具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用，其中主要包括: 激活巨噬細(xì)胞、增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能自然殺傷細(xì)胞(NK)，調(diào)節(jié)和增加單核細(xì)胞毒作用，刺激產(chǎn)生相關(guān)的細(xì)胞因子，活化B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，增強(qiáng)其作用，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，調(diào)節(jié)紅細(xì)胞免疫，影響蛋白質(zhì)的合成及抗體的生成，影響機(jī)體免疫信息：如調(diào)節(jié)炎癥中Th1/Th2失衡，調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的比例，調(diào)節(jié)cAMP和cGMP濃度和相對(duì)比值，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫(NM)網(wǎng)絡(luò)，打破機(jī)體免疫系統(tǒng)損傷造成的免疫耐受，提高免疫系統(tǒng)對(duì)抗原的識(shí)別能力等。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，低分子柑桔果膠通過阻斷脂多糖信號(hào)通路抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的前炎癥反應(yīng)[4]。McCarty等[5]研究表明MCP富含半乳糖單體，與Galectin-3有極強(qiáng)的親和性，通過結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面豐富的Galectin-3，使得腫瘤的生長(zhǎng)直接受到抑制，另一方面腫瘤生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)源也被切斷，因而抑制腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移。目前國(guó)外已用于腫瘤領(lǐng)域的臨床治療。而在糖尿病、高血脂、鉛中毒等方面的防治也正成為研究的熱點(diǎn)[6]。是否MCP能用于哮喘的防治，目前國(guó)內(nèi)外尚沒有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立急性哮喘小鼠模型，以MCP作為干預(yù)藥物，初步探討其對(duì)哮喘氣道炎癥的調(diào)節(jié)作用及可能機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明C組肺組織支氣管及血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，BALF液涂片EOS%較B組明顯下降，血清和BALF液中IL-4濃度降低，提示其有一定程度的抗炎及調(diào)整Th1/Th2的作用。MCP可能是通過增強(qiáng)免疫功能來糾正Th1/Th2失衡。但C組效果不及D組，提示其可作為有效的免疫調(diào)節(jié)劑輔佐糖皮質(zhì)激素用于哮喘的治療，以期更好地控制哮喘，減少激素用量。C組NF-κB蛋白的表達(dá)較B組明顯降低，提示MCP有抑制NF-κB信號(hào)通路的作用，這也可能是其改善氣道炎癥、調(diào)節(jié)Th1/Th2失衡的又一分子機(jī)制。通過本實(shí)驗(yàn)研究表明，MCP對(duì)氣道炎癥有一定的調(diào)節(jié)作用，其可能機(jī)制為： 通過抑制前炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)而抑制NF-κB信號(hào)通路的活化； 直接抑制NF-κB蛋白，阻斷NF-κB通路的信號(hào)傳遞。

MCP的應(yīng)用劑量是根據(jù)臨床用于調(diào)節(jié)免疫功能的劑量轉(zhuǎn)換而來。因此，MCP合理的劑量范圍尚有待進(jìn)一步研究確定。通過對(duì)本研究中量效關(guān)系的分析發(fā)現(xiàn)，MCP降低哮喘小鼠氣道炎癥，調(diào)節(jié)Th1/Th2失衡，阻斷NF-κB通路的信號(hào)傳遞。這些發(fā)現(xiàn)提示MCP可作為一種新的有免疫調(diào)節(jié)劑用于哮喘的治療，這將為支氣管哮喘的藥物和飲食治療開辟一條新的途徑。

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Effect of Modified Citrus Pectin on the Expression of Nuclear Factor NF-Kappa B and Th1/Th2 Balance in Mice of Asthma

HUANG Juan,LIU Xiu-fen,ZHAO Hong-ling,et al

(XianningCentralHospital,XianningHubei437100，China)

ABSTRACT：Objective To discuss the role of nuclear factor kappa-B and Th1/Th2 immune imbalance in the model mice of asthma and the mechanism of low molecular citrus fruit powder. Methods BALB/c mice were randomly divided into four groups:the control group，asthma group ，MCP treated group and DXM treated group.In the experiment，the mouse model of asthma was established by the ovalbumin( OVA) challenge methods.The cell numbers and differentiated cell numbers in BALF were counted by different counting fluids；Application of ELISA methods to detect concentration IL-4，IFN-γ in BALF；The protein expression of NF-κB were detected by Immuno-histochemistry(IHC).Results Compared with asthma group，The level of IL-4 in serum and BALF of MCP treated group had a markedly decrease(P<0.05)；The protein expresstion of NF-κB in MCP treated group were significantly decrease than asthma group；There was a positive correlation between NF-κB in lung and IL-4 in BALF(P﹤0.05)，A negative correlation between the level of IFN-γin BALF(P<0.01).Conclusion Low molecular citrus fruit powder can reduce the inflammatory cytokines of IL-4，relieve lung tissue pathology damage in the mice mode of asthma.The mechanisms may be regulate Th1/Th2 balance and restrain the nf-kappa B activation，reduce airway epithelium nf-kappa B expression，so as to prevent the occurrence of asthma.

KEY WORDS：Modified Citrus Pectin；Asthma;NF-κB;IL-4;IFN-γ;Th1/Th2 balance

(收稿日期：2016-02-04)

DOI:10.16751/j.cnki.2095-4646.2016.02.0102

中圖分類號(hào)：R-332

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：2095-4646(2016)02-0102-04

基金項(xiàng)目：湖北科技學(xué)院校級(jí)科研項(xiàng)目(zx1314)

**通訊作者：E-mail:308138353@qq.com