江靜嫻 張敏敏 楊驊 吳洪玉 鄒多武 李兆申

·論著·

CⅡTA基因調(diào)控胰腺腫瘤細胞MHCⅡ類分子表達的體外研究

江靜嫻 張敏敏 楊驊 吳洪玉 鄒多武 李兆申

目的研究CⅡTA基因?qū)θ艘认侔〤aPanC-2細胞和小鼠胰腺癌PanC-02細胞主要組織相容性復(fù)合物(MHC)Ⅱ類分子表達的影響。方法將攜帶CⅡTA基因的腺病毒(Ad-CⅡTA)分別感染人胰腺癌CaPanC-2細胞和小鼠胰腺癌PanC-02細胞，培養(yǎng)24、48、72 h。實時PCR法檢測感染細胞CⅡTA mRNA的表達，蛋白質(zhì)印跡法檢測CⅡTA蛋白表達，流式細胞儀檢測MHCⅡ類分子陽性表達細胞百分比。結(jié)果CaPanC-2細胞感染后24、48、72 h的CⅡTA mRNA表達量分別為對照組的(16769±6455)、(261568±348850)和(834816±97783)倍(P<0.05)；PanC-02細胞為對照組的(548546±87755)、(1242684±624888)和(1401647±726145)倍(P<0.05)。CaPanC-2和PanC-02細胞均不表達CⅡTA蛋白，感染后48 h，CaPanC-2、PanC-02細胞CⅡTA蛋白表達量為0.746±0.499和0.631±0.244。感染24、48、72 h組CaPanC-2細胞表達MHCⅡ類分子的細胞百分比分別為(8.1±0.3)%、(18.9±0.3)%、(78.5±0.9)%，顯著高于對照組的(7.0±0.1)%(P<0.01)；PanC-02細胞表達MHCⅡ類分子的細胞百分比分別為(5.1±0.2)%、(37.3±2.0)%、(68.8±2.2)%，顯著高于對照組的(2.2±0.2)%(P<0.01)。結(jié)論Ad-CⅡTA體外感染胰腺腫瘤細胞可促進CⅡTA基因的表達，從而促進細胞表面MHCⅡ類分子的表達。

胰腺腫瘤； 主要組織相容性復(fù)合物； 腺病毒； 感染

主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex,MHC)Ⅱ類分子的表達分為組成型和誘導(dǎo)型，其表達的調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平[1]。MHCⅡ類反式激活因子(MHC class Ⅱ transactivator,CⅡTA)是MHCⅡ類基因表達的“分子開關(guān)”，其對MHCⅡ類分子的表達調(diào)控有著專一性和有效性[2]。外源性CⅡTA能夠促進MHCⅡ類基因轉(zhuǎn)錄的激活[3]，改變MHCⅡ類分子的表達，增強腫瘤的免疫原性及T細胞對腫瘤細胞的識別能力，促進腫瘤細胞抗原的遞呈，從而達到激活機體免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細胞的目的[4]。為此，我們利用構(gòu)建好的重組腺病毒載體Ad-CⅡTA體外感染胰腺癌細胞株CaPanC-2和PanC-02，證實通過腺病毒介導(dǎo)的外源性CⅡTA基因能夠促進MHCⅡ類分子的表達，為胰腺癌的腫瘤免疫治療提供了新的途徑和啟示。

材料和方法

一、腺病毒Ad-CⅡTA感染胰腺癌細胞株

人胰腺癌細胞株CaPanC-2和小鼠胰腺癌細胞株P(guān)anC-02為本實驗室保存。攜帶CⅡTA基因的腺病毒(Ad-CⅡTA)為本實驗室先期制備。細胞株常規(guī)培養(yǎng)傳代后取對數(shù)生長期細胞，以每孔5×106個細胞接種于6孔板，加入含IFN-γ 500 U/ml(Peprotech公司)的培養(yǎng)基常規(guī)孵育48 h，換不含血清的opti-MEM培養(yǎng)基饑餓細胞4 h，加入Ad-CⅡTA轉(zhuǎn)染兩種細胞株，病毒量為100 MOI，8 h后更換為正常的含10%小牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，在熒光倒置顯微鏡下觀察呈現(xiàn)綠色熒光的感染細胞。

二、實時PCR法檢測感染細胞CⅡTA mRNA表達

收集感染的細胞，應(yīng)用Trizol裂解液(Takara公司)抽提細胞總RNA。引物序列：小鼠CⅡTA上游5′-AAGCAGGACAGAAGCCTCAGAA-3′，下游5′-GCTTCCTGTGCTTGAGTCCAT-3′，擴增片段369 bp；小鼠內(nèi)參GAPDH上游5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′，下游5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′，擴增片段233 bp；人CⅡTA上游5′-ACGCTT-TCTGGCTGGATTAGT-3′，下游5′-TCAACGCCA-GTCTGACGAAGG-3′，擴增片段342 bp；人內(nèi)參GAPDH上游5′-TGACCCTGAAGTACCCCATTG-3′，下游5′-TCAGGATCTTCATGAGGTAG-3′，片段387 bp。引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。逆轉(zhuǎn)錄和實時PCR試劑均購自Takara公司。逆轉(zhuǎn)錄條件：37℃ 15 min，85℃ 5 s。PCR反應(yīng)條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s、60℃ 34 s，40個循環(huán)。采用相對定量2-△△Ct法計算mRNA表達倍數(shù)?！鰿t值=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值；△△Ct值=目的基因△Ct值-內(nèi)參基因△Ct值；以對照組表達量為1，2-△△Ct值即為目的基因的表達倍數(shù)。實驗重復(fù)5次，取均值。

三、蛋白質(zhì)印跡法檢測感染細胞CⅡTA蛋白表達

收集細胞后加入蛋白裂解液(Thermo公司)提取蛋白，取30 μg蛋白常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測CⅡTA蛋白表達。小鼠抗人、兔抗小鼠CⅡTA單抗為Santa Cruz公司產(chǎn)品，HRP標記山羊抗鼠、山羊抗兔為上海博邁公司產(chǎn)品。以β-actin作為內(nèi)參。最后ECL顯影，圖像分析儀掃描，以目的條帶與β-actin條帶灰度值比作為目的蛋白的相對表達量。

四、流式細胞儀檢測感染細胞MHCⅡ類分子的表達

收集對照組和感染后24、48、72 h的細胞，PBS洗滌后加入熒光蛋白GFP標記的抗馬MHC Ⅱ類(I-A/I-E)PE或抗人HLA-DR PE(eBioscience公司)孵育15 min進行標記，用PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測GFP陽性細胞百分比。

五、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、細胞感染后CⅡTA mRNA表達的變化

Ad-CⅡTA感染后24、48、72 h，CaPanC-2細胞CⅡTA mRNA表達呈時間依賴性明顯上調(diào)，分別為對照組的(16769±6455)、(261568±348850)和(834816±97783)倍(P<0.05)；PanC-02細胞CⅡTA mRNA表達亦呈時間依賴性明顯上調(diào)，分別為對照組的(548546±87755)、(1242684±624888)和(1401647±726145)倍(P<0.05)。

二、細胞感染后CⅡTA蛋白表達的變化

CaPanC-2和PanC-02細胞均不表達CⅡTA蛋白。感染后48 h，CaPanC-2細胞CⅡTA蛋白表達量為0.746±0.499；PanC-02細胞的表達量為0.631±0.244(圖1)。

1：CaPanC-2細胞的空白對照；2：腺病毒感染的CaPanC-2；3：PanC-02細胞的空白對照；4：腺病毒感染的PanC-02

圖1各組細胞CⅡTA蛋白表達

三、感染后表達MHCⅡ類分子的細胞百分比

感染24、48、72 h組表達MHCⅡ類分子的CaPanC-2細胞百分比分別為(8.1±0.3)%、(18.9±0.3)%、(78.5±0.9)%，顯著高于對照組的(7.0±0.1)%、(7.0±0.1)%、(6.9±0.2)%(P值均<0.01)；表達MHCⅡ類分子的PanC-02細胞百分比分別為(5.1±0.2)%、(37.3±2.0)%、(68.8±2.2)%，顯著高于對照組的(2.2±0.2)%、(2.2±0.2)%、(2.1±0.3)%(P值均<0.01)。

討 論

CⅡTA是在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控MHCⅡ類分子表達的最關(guān)鍵因子之一,CⅡTA的表達降低可導(dǎo)致腫瘤細胞MHCⅡ類分子表達下降[4-6]，影響與MHCⅡ類分子相關(guān)的免疫功能[7]。Satoh等[5]證實，高水平的MHCⅡ類分子表達常與較好的腫瘤患者預(yù)后密切相關(guān)。因此，通過CⅡTA干預(yù)MHCⅡ類分子功能可能是治療腫瘤的理想靶點。Lu等[8]應(yīng)用細胞感染方法將腫瘤細胞感染成MHC(+)/Ii(-)表型，然后種植到BALB/c鼠成瘤，結(jié)果有效引發(fā)了CD4+Th細胞抗腫瘤免疫應(yīng)答。Meazza等[9]用CⅡTA基因轉(zhuǎn)染MHCⅡ缺乏的高度惡性的小鼠乳腺癌細胞株TS/A，恢復(fù)了MHCⅡ類分子抗原表達，使其重新獲得了免疫原性。

本結(jié)果顯示，人胰腺癌細胞株CaPanC-2和小鼠胰腺癌細胞株P(guān)anC-02均無CⅡTA的蛋白表達，感染后兩株細胞株中CⅡTA mRNA和蛋白的表達較前顯著增強，同時MHCⅡ類分子的表達亦顯著增強。由此證明，利用重組腺病毒載體制備新型、高效的腫瘤疫苗，外源性加入CⅡTA基因，可增強胰腺腫瘤細胞表面MHCⅡ類分子的表達，進而促進T細胞對胰腺腫瘤細胞抗原的識別，介導(dǎo)T細胞激活，對胰腺癌細胞產(chǎn)生免疫治療反應(yīng)。

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2011-03-25)

(本文編輯：呂芳萍)

RegulationofMHCclassⅡtransactivatoronMHCclassⅡexpressionofpancreaticcancercelllineCaPanC-2andPanC-02invitro

JIANGJing-xian，ZHANGMin-min，YANGHua，WUHong-yu，ZOUDuo-wu，LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

Correspondingauthor:ZHANGMin-min,Email:minminzhang2002@126.com

ObjectiveTo investigate the effect of MHC classⅡtransactivator(MHCⅡ TA ) on MHCⅡexpression of human and rat pancreatic cancer cell line CaPanC-2 and PanC-02.MethodsThe recombinant adenovirus (Ad-CⅡTA) was transfected into the CaPanC-2 cell and the PanC-02 cell, then it was cultured for 24, 48, 72 h. The CⅡTA mRNA expressions were assayed by Real Time PCR and CⅡTA protein expressions were determined by Western blotting. The percentage of positive expression cells of MHC Ⅱ were measured by flow cytometry.ResultsThe CⅡTA mRNA expressions of CaPanC-2 cell at 24, 48, 72 h were 16769±6455, 261568±348850 and 834816±97783 folds higher than that of control group (P<0.05). The CⅡTA mRNA expressions of PanC-02 was 548546±87755, 1242684±624888 and 1401647±726145 folds higher than that of control group (P<0.05). CⅡTA protein was not expressed in CaPanC-2 cell and PanC-02 cell. After transfection for 48 h, the CⅡTA protein expressions of CaPanC-2 and PanC-02 were 0.746±0.499 and 0.631±0.244. The percentage of positive expression cells of MHC Ⅱ in CaPanC-2 cells after 24, 48, 72 h were (8.1±0.3)%, (18.9±0.3)%, (78.5±0.90%, which were significantly higher than that in control group [(7.0±0.1)%,P<0.01. The percentage of positive expression cells of MHC Ⅱ in PanC-02 were (5.1±0.2)%, (37.3±2.0)%, (68.8±2.2)%, which were significantly higher than that in control group [(2.2±0.2)%,P<0.01).ConclusionsTransfection of Ad-CⅡTA could increase the expression of CⅡTA and MHC Ⅱ molecules of pancreatic tumor cells in vitro.

Pancreatic neoplasms; Major histocompatibility complex; Adenoviruses; Infection

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.03.007

國家自然科學(xué)基金(30600752)

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院消化內(nèi)科

張敏敏，Email: minminzhang2002@126.com