裴繼誠 于秀玲 張方東

(天津科技大學(xué)天津市制漿造紙重點實驗室，天津，300457)

漆酶/對羥基苯甲酸丁酯處理未漂漿提高抗菌性能的研究

裴繼誠 于秀玲 張方東

(天津科技大學(xué)天津市制漿造紙重點實驗室，天津，300457)

從提高紙張抗菌性能角度出發(fā)，研究了漆酶/對羥基苯甲酸丁酯處理未漂硫酸鹽漿后紙樣抗菌性能的變化。結(jié)果表明，漆酶/對羥基苯甲酸丁酯處理未漂硫酸鹽漿抄造的紙樣能較好地抑制細(xì)菌的生長，對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌率分別為94.50%、90.87%、98.99%和99.12%。耐洗實驗結(jié)果表明，紙樣經(jīng)4次洗脫后其抑菌率變化不大，推測對羥基苯甲酸丁酯在漆酶作用下與纖維發(fā)生化學(xué)鍵連接而非簡單的物理吸附。通過漿料卡伯值的測定和掃描電鏡的檢測結(jié)果間接表明了對羥基苯甲酸丁酯在漆酶的作用下可以接枝到纖維表面，表現(xiàn)為卡伯值增加，纖維表面有沉積物及纖維間生成連接膜。

漆酶;對羥基苯甲酸丁酯;未漂硫酸鹽漿;抗菌活性

近年來，受健康消費(fèi)理念的影響，人們越來越重視產(chǎn)品是否具有抗菌性能［1］，尤其在食品行業(yè)，采用抗菌紙包裝食品，從而最大限度降低防腐劑的用量，這引起廣泛關(guān)注［2］。生活中大部分的抗菌紙是在紙張生產(chǎn)過程中，通過濕部添加、表面施膠、噴淋、浸漬、涂布抗菌劑等方式制得，使其獲得抗菌性［3］。然而濕部添加、浸漬、涂布等方式存在著涂布量不均、抗菌劑易溶出擴(kuò)散等缺陷。

酚類物質(zhì)作為有機(jī)抗菌劑的一種，可以作為自由基吸收劑而起到抗氧化作用。已有研究表明，一些天然物中提取的酚類物質(zhì)可以較好地抵制微生物的生長［4-5］。漆酶是一種含銅多酚氧化酶，可催化氧化多種酚類及芳香胺底物，進(jìn)而賦予纖維一些特性［6］。近幾年來，一些學(xué)者對漆酶/酚類物質(zhì)改善植物纖維性能進(jìn)行了初步探討。Fillat A等人［7］應(yīng)用漆酶/對香豆酸對丙酮抽提后的麻漿進(jìn)行處理可有效地改善纖維的性能。G Elegir等人［8］對未漂硫酸鹽漿的手抄片(定量140 g/m2)進(jìn)行漆酶/丁香酚處理，研究結(jié)果表明，漆酶能有效地催化氧化丁香酚，并賦予紙張良好的抗菌性能。

對羥基苯甲酸酯是有效的防腐劑和抑菌劑，可用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)［9］。本實驗利用對羥基苯甲酸丁酯良好的抑菌性能，研究漆酶/對羥基苯甲酸丁酯處理未漂硫酸鹽漿后紙樣的抗菌效果，并對其抗菌機(jī)理進(jìn)行初步探討，為漆酶/酚類物質(zhì)處理后的抗菌紙樣在食品行業(yè)的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 實驗

1.1 原料

未漂硫酸鹽漿:金星牌商品漿;漆酶:由Novozymes A/S提供，商品名NOVOZYM-51003，酶活1070 U/g;對羥基苯甲酸丁酯購于Sigma-Aldrich化學(xué)公司;實驗菌種:金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌由天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院提供。

1.2 儀器

1107型漿料疏解器，瑞典Lorentzen＆Wettre Co.Ltd制造;P40110 E000型PFI磨，奧地利PTI有限公司制造;900428型快速紙頁成形器，德國ESTANIT GmbH制造;SEM X-300掃描電子顯微鏡，Philips FEI QUANTA 200制造;HNY-100B恒溫培養(yǎng)振蕩器，天津市歐諾儀器儀表有限公司制造。

1.3 方法

1.3.1 對羥基苯甲酸丁酯的抑菌效果

采用牛津杯法檢測對羥基苯甲酸丁酯的抑菌能力。首先取菌濃為105～106CFU/mL的指示菌培養(yǎng)物0.1 mL滴加到平板 (直徑為90 mm)上，采用涂布棒將平板均勻涂滿，自然干燥30 min，然后將牛津杯均勻放置在平板上，每個平板放1個，最后向其中加入待測液0.2 mL(待測酚類物質(zhì)濃度為0.015 g/mL)，37℃培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑。每個樣品做3次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。

1.3.2 漿料的處理

未漂硫酸鹽漿經(jīng)去離子水浸泡、疏解后，采用PFI磨打漿至45°SR，備用。

漆酶/對羥基苯甲酸丁酯處理:取4 g絕干未漂硫酸鹽漿，稀釋至漿濃4%，調(diào)解漿料pH值為5，加入預(yù)先用乙醇溶解的對羥基苯甲酸丁酯 (添加量為絕干漿的3.5%)，通空氣充分?jǐn)嚢? min后加入漆酶 (18 U/g)，置于溫度已達(dá)到50℃的恒溫?fù)u床內(nèi)，以100 r/min處理4 h。

對照樣:單獨(dú)漆酶處理及單獨(dú)對羥基苯甲酸丁酯處理，其他處理條件不變。

1.3.3 紙樣抗菌性能的檢測

采用改良奎因法檢測紙張的抑菌效果［10］。將指示菌配成105～106CFU/mL的菌懸浮液，備用。將紙張裁成大小為25 mm×25 mm的紙片放入直徑為90 mm的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，均勻滴加0.5 mL菌液置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)干燥1 h，干燥后的紙片平貼于營養(yǎng)瓊脂平板表面，再用半固體營養(yǎng)瓊脂均勻覆蓋紙樣表面，置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，每個樣品做6次重復(fù)實驗。采用活菌計數(shù)法測定其活菌數(shù)，計算見式 (1)。

式中，K為活菌數(shù);A為從空白樣回收的平均菌數(shù);B為從抗菌紙樣回收的平均菌數(shù)。

1.3.4 紙樣溶出類型的判定及紙樣耐洗實驗［11］

依據(jù)紡織行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) FZ/T73023附錄E和GB8629—2001分別對紙樣進(jìn)行溶出性評價及耐洗測試。

1.3.5 卡伯值測定

根據(jù)GB/T1546—2004方法測定處理前后未漂硫酸鹽漿的卡伯值。

1.3.6 掃描電鏡觀察

將紙樣裁成一定大小噴金后，在掃描電鏡上觀察并照相，加速電壓為20 kV。

2 結(jié)果與討論

2.1 對羥基苯甲酸丁酯的抑菌效果

采用二甲基亞砜溶解對羥基苯甲酸丁酯，溶液濃度為0.015 g/mL。取0.2 mL對羥基苯甲酸丁酯溶液滴加到牛津杯中，37℃培養(yǎng)24 h，其抑菌效果以抑菌圈直徑為標(biāo)準(zhǔn)，抑菌活性3次重復(fù)實驗差異不顯著(P≤0.05)，抑菌效果如表1所示。由表1可知，對照樣二甲基亞砜的抑菌圈直徑為0 mm，說明其本身無抑菌效果，而對羥基苯甲酸丁酯對各實驗菌抑菌圈直徑在20.0～25.0 mm，表明對羥基苯甲酸丁酯具有良好的抑菌活性。

表1 對羥基苯甲酸丁酯抑菌效果

2.2 紙樣抗菌性能分析

牛津杯法適用于檢測溶出類型產(chǎn)品的抗菌性能，本實驗中紙張屬于非溶出型，因此采用改良奎因法檢測不同處理方式后紙樣的抑菌效果，3次重復(fù)實驗差異不顯著 (P≤0.05)，實驗結(jié)果見表2。

表2 不同方式處理漿料所得紙樣的抑菌率 %

與空白樣相比，單獨(dú)漆酶處理的紙樣無抑菌效果。添加對羥基苯甲酸丁酯及漆酶/對羥基苯甲酸丁酯處理后的紙樣均具有不同程度的抑菌效果，漆酶/對羥基苯甲酸丁酯的抑菌趨勢與對羥基苯甲酸丁酯抑菌趨勢基本相同，漆酶/對羥基苯甲酸丁酯處理的紙樣對實驗菌種的抑菌效果更佳，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌的抑菌率分別為94.99%、98.99%、90.87%和99.12%。對羥基苯甲酸丁酯本身對大腸桿菌、沙門氏菌具有較好的抑菌效果，而經(jīng)漆酶/對羥基苯甲酸丁酯處理后的紙樣對大腸桿菌、沙門氏菌抑菌率幾乎達(dá)100%，對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌同樣具有良好的抑菌性能。

2.3 紙樣的溶出類型評價及耐洗性測試

紙樣抑菌實驗結(jié)果表明，單獨(dú)添加對羥基苯甲酸丁酯處理的紙樣也具有抗菌性，為了驗證對羥基苯甲酸丁酯與漿料中的纖維是否發(fā)生化學(xué)連接，對單獨(dú)添加對羥基苯甲酸丁酯處理的紙樣及漆酶/對羥基苯甲酸丁酯處理的紙樣進(jìn)行溶出性測試及耐洗實驗。

表3 不同處理方式紙樣溶出性評價

表3為紙樣對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的溶出性評價。從表3中可以看出，與空白樣相比，添加漆酶/對羥基苯甲酸丁酯的紙張對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌帶寬均＜1.0 mm，而僅添加對羥基苯甲酸丁酯處理的紙樣抑菌帶＞1.0 mm。參考FZ/T73023—2006附錄E判斷:漆酶/對羥基苯甲酸丁酯處理紙樣屬于非溶出型，單獨(dú)對羥基苯甲酸丁酯處理紙樣屬于溶出型。推測認(rèn)為，單獨(dú)添加對羥基苯甲酸丁酯處理漿料，由于對羥基苯甲酸丁酯的水溶性較差，處理過程中一部分在抄片過程中流失，另一部分與纖維間發(fā)生物理吸附;而對羥基苯甲酸丁酯在漆酶催化下，與纖維發(fā)生了化學(xué)鍵連接，幾乎無溶出。

對不同處理方式的紙樣進(jìn)行耐洗實驗并進(jìn)行抑菌測試，重復(fù)實驗差異不顯著 (P≤0.05)，結(jié)果見表4。實驗結(jié)果表明，漆酶/對羥基苯甲酸丁酯處理所得紙樣隨著洗脫次數(shù)的增加，抑菌率變化很小，經(jīng)4次耐洗實驗后，紙樣抑菌率降低7%左右;而僅用對羥基苯甲酸丁酯處理紙樣隨洗脫次數(shù)的增加抑菌率顯著降低。這進(jìn)一步說明，在漆酶的催化氧化作用下對羥基苯甲酸丁酯與纖維之間發(fā)生了化學(xué)作用，而不是簡單的物理吸附，處理后紙樣具有良好的耐洗性，其抑菌率隨洗滌次數(shù)增加變化不大。

表4 不同處理方式紙樣多次洗脫后的抑菌率 %

2.4 卡伯值測定及掃描電鏡分析

前面的實驗表明，漆酶/對羥基苯甲酸丁酯處理未漂硫酸鹽漿可以有效提高紙樣的抗菌性能，通過紙樣溶出性評價及耐洗性測試結(jié)果推測對羥基苯甲酸丁酯在漆酶催化氧化作用下與纖維產(chǎn)生了化學(xué)鍵連接。為了更深入地研究對羥基苯甲酸丁酯對紙張抗菌性能的影響，對處理漿料的卡伯值及不同處理方式的紙樣的表面形貌進(jìn)行了分析，分別見表5和圖1。

表5表明，單獨(dú)使用漆酶處理漿料卡伯值略有降低，而使用漆酶/對羥基苯甲酸丁酯體系處理漿料的卡伯值提高了6.13%。推測纖維卡伯值增加的可能原因是由于漿料中添加對羥基苯甲酸丁酯后，對羥基苯甲酸丁酯在漆酶的作用下與紙漿中木素產(chǎn)生了連接，進(jìn)而提高漿料卡伯值。Fillat A等人［7］的實驗也表明，漆酶/酚類化合物處理未漂化學(xué)漿，其卡伯值有所提高。

圖1 不同處理方式所得紙樣掃描電鏡圖

表5 漿料處理前后卡伯值變化

掃描電鏡分析發(fā)現(xiàn)，漆酶/對羥基苯甲酸丁酯處理可以對纖維表面進(jìn)行有效地改性。圖1(a)為未經(jīng)漆酶處理的空白紙樣，纖維表面光滑、平整，纖維之間只是簡單地相互交織在一起;單獨(dú)使用漆酶處理的紙樣見圖1(b)，部分纖維表面變得粗糙并產(chǎn)生“自黏合”;采用漆酶/對羥基苯甲酸丁酯處理的紙樣見圖1(c)，纖維表面更加粗糙，并且可以觀察到纖維表面有沉積物及纖維間相互“黏結(jié)”，出現(xiàn)大面積的纖維“融結(jié)”現(xiàn)象。其原因可能是采用漆酶/對羥基苯甲酸丁酯處理紙漿的過程中，對羥基苯甲酸丁酯被催化氧化后與木素發(fā)生了化學(xué)鍵連接。

由上述分析結(jié)果可以推測，對羥基苯甲酸丁酯本身具有良好的抵制細(xì)菌生長的能力，被漆酶催化氧化后與纖維以一定的方式結(jié)合而非簡單的物理吸附，同時保留了其抗菌基團(tuán)，進(jìn)而提高了紙張的抗菌性能。

3 結(jié)論

3.1 對羥基苯甲酸丁酯與漆酶協(xié)同作用處理未漂硫酸鹽漿，與空白樣相比，所得紙樣經(jīng)改良奎因法檢測具有較好的抑制微生物生長的能力，抑菌趨勢與對羥基苯甲酸丁酯抑菌效果基本相符。

3.2 紙樣溶出性評價及耐洗實驗間接證明了對羥基苯甲酸丁酯在漆酶的催化氧化作用下能夠沉積到纖維上，與纖維表面木素形成化學(xué)鍵連接，從而賦予紙張良好的抗菌特性。

3.3 漆酶/對羥基苯甲酸丁酯處理后的漿樣與空白漿樣相比卡伯值顯著增加。通過掃描電鏡分析，纖維間相互“黏結(jié)”，有膜狀物和沉淀物生成。

［1］Vartiainen J，Motion R，Kulonen H，et al．Chitosan-coated paper:Effects of nisin and different acids on the antimicrobial activity［J］．Applied Polymer Science，2004，94(3):986

［2］Cha DS，Chinnan MS．Biopolymer-based antimicrobial packaging:a review［J］．Crit．Rev．Food Sci．Nutr．，2004(44):223．

［3］楊開吉，蘇文強(qiáng)，陳京環(huán)．多功能抗菌紙的開發(fā)與應(yīng)用［J］．中國造紙，2007，26(9):44．

［4］Wong KKY，Richardson JD，Mansfield SD．Enzymatic treatment of mechanical pulp for improving papermaking properties［J］．Biotechnol．Prog．，2000，16:1025．

［5］Felby C，Hassingboe J，Lund M．Pilote-scale production of fibreboards made by laccase oxidized wood fibers:board properties and evidence for cross-linking of lignin［J］．Enzyme MicrobTechnol，2002，31:736．

［6］Sandile Ncanana，Lara Baratto，Lucia Roncaglia．Laccase-Mediated Oxidation of Totarol［J］．Full papers，2007，349:1507．

［7］Fillat A，Gallardo O，Vidal T．Evaluation of natural mediators for developing antimicrobial properties to pulp fibres［C］．ISWFPC，2009．

［8］G Elegir，A Kindl，P Sadocco，et al．Development of antimicrobial cellulose packaging through laccase-mediated grafting of phenolic compounds［J］．Enzyme and Microbial Technology，2008，43(2):84．

［9］楊壽清．對羥基苯甲酸酯衍生物的抗菌活性及其發(fā)展趨勢［J］．食品添加劑，2004，10(4):25．

［10］隆 泉，鄭保忠，孔 輝．抗菌織物的抗菌性快速檢測方法研究:奎因法的改良［J］．上海紡織科技，2007(4):52．

［11］金永安，姜 生，路 娟．紡織品抗菌性能檢測方法及其評估［J］．北京紡織，2005，26(1):49．

Improving the Antimicrobial Activity of Unbleached Kraft Pulp by Treatment with Laccase and Butyl 4-Hydroxybenzoate

PEI Ji-cheng*YU Xiu-ling ZHANG Fang-dong
(Tianjin Key Lab of Pulp＆ Paper，Tianjin University of Science＆ Technology，Tianjin，300457)
(*E-mail:jcpei@tust edu cn)

In order to improve the antimicrobial activity of paper，the antimicrobial activity of the paper manufactured with the kraft pulp which was treated with laccase/buty1 4-hydroxybenzoate was evaluated．The experimental results showed that，the handsheet paper containing laccase and butyl 4-hydroxybenzoate showed a greater efficiency against the growth of bacteria，which resisted s．a(chǎn)ureus，bacillus subtilis，e．coli，salmonella to 94．50%，90．87%，98．99%，and 99．12%respectively．There was little change of anti-bacteria effect of the handsheet paper after washing four times，which indicated that the chemical bonds between butyl 4-hydroxybenzoate and fibers probably were formed in the presence of laccase．After the enzymatic treatment，kappa number increase compared with the control sample，and the observation of scanning electron microscope(SEM)indicated that fibers treated by laccase and butyl 4-hydroxybenzoate were agglutinated together in wide area，which indicated that the phenol compounds may be linked to the surface of fibers by covalent bond to some extent．

lacccase;butyl 4-hydroxybenzoate;unbleached kraft pulp;antimicrobial activity

TS761.6

A

0254-508X(2011)09-0011-04

裴繼誠先生，教授;主要從事廢紙再生與利用技術(shù)及木素生物改性方面的研究工作。

2011-04-08(修改稿)

(責(zé)任編輯:郭彩云)