裴曉林，李誠璐，王秋巖，謝開林，傅陳露，張 勇，謝 恬

(杭州師范大學(xué)生物醫(yī)藥與健康研究中心，浙江 杭州 310012)

響應(yīng)面法優(yōu)化大腸桿菌表達(dá)Hyperthermus butylicus耐熱醛縮酶誘導(dǎo)條件的研究

裴曉林，李誠璐，王秋巖，謝開林，傅陳露，張 勇，謝 恬

(杭州師范大學(xué)生物醫(yī)藥與健康研究中心，浙江 杭州 310012)

為了提高重組耐熱2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶的表達(dá)水平，該文基于中心組合實(shí)驗(yàn)的響應(yīng)面分析方法，對(duì)基因工程E.coli的誘導(dǎo)條件進(jìn)行了優(yōu)化，具體考察因素包括誘導(dǎo)劑(異丙基-β-D-硫代半乳糖，IPTG)濃度和誘導(dǎo)時(shí)機(jī).實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法可以提高目標(biāo)蛋白的表達(dá)量，依據(jù)回歸分析確定了最佳誘導(dǎo)條件為：IPTG濃度0.57 mM，誘導(dǎo)時(shí)機(jī)OD600為0.76，理論最佳DERA的比活力為1.124 u/mg，而實(shí)際平均比活力達(dá)到1.178 u/mg，兩者幾乎相等，說明該模型與實(shí)際情況基本相符.

2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶；響應(yīng)面；中心組合；誘導(dǎo)條件；大腸桿菌

0 前 言

不對(duì)稱醛醇縮合反應(yīng)在精細(xì)化學(xué)品制備中是一類極為重要的反應(yīng)，目前主要采用金屬離子的催化，而由醛縮酶催化的生物方法顯示出更高的環(huán)境友好性[1].2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶(2-Deoxyribose-5-phophate aldolases，DERAs, EC 4.1.2.4)屬于第Ⅰ類醛縮酶，催化乙醛和D-3-磷酸甘油醛之間的縮合反應(yīng)，形成5-磷酸-2-脫氧核糖[2].值得注意的是，DERAs與其它醛縮酶比較，最大的區(qū)別在于其底物和產(chǎn)物都是醛類，因此可以催化連續(xù)的醛縮反應(yīng)[3].研究表明，該酶以3分子的乙醛為底物，經(jīng)過2步連續(xù)的縮合生成2,4,6-三脫氧己糖，可以作為中間體應(yīng)用于抗癌藥物Epothilone A和C、 Iminocyclitols，以及降血脂藥物Statins類等的合成中[4-5].到目前為止,不同的DETAs已經(jīng)被報(bào)道和研究，包括原核、真核和古細(xì)菌[6-7]，而來源于嗜熱微生物的DERAs由于其較高的熱穩(wěn)定性和有機(jī)溶劑耐受性更加引人關(guān)注.2007年，Sakuraba等報(bào)道了兩種嗜熱微生物的醛縮酶，即DERAPae和DERATma，顯示出較高的連續(xù)催化效率和底物耐受性[8].Wang等也報(bào)道了不同來源的耐熱DERAs，表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性和乙醛耐受性[9-10].

基因工程E.coli生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物不僅與宿主自身的遺傳特性有關(guān)，而且與營養(yǎng)環(huán)境和表達(dá)條件密切聯(lián)系，其中誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)重組蛋白的表達(dá)影響最為明顯[11-13].對(duì)重組蛋白誘導(dǎo)條件優(yōu)化的經(jīng)典方法是單因子法，但是當(dāng)影響因素較多時(shí)需要大量的實(shí)驗(yàn)次數(shù)，而且可能導(dǎo)致不可靠的甚至錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)結(jié)論，尤其對(duì)具有交互作用的影響因素.響應(yīng)面分析方法(Response surface methodology,RSM)，包括因素設(shè)計(jì)和回歸分析，依據(jù)有限的實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)各種影響因素和構(gòu)建模型，并考察各因素之間的交互影響，最終預(yù)測最優(yōu)化的環(huán)境條件[14].該研究以實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的耐熱DERA重組菌株E.coliBL21(pET303-DERA008)為對(duì)象，采用中心組合設(shè)計(jì)(Central composite design,CCD)優(yōu)化該酶表達(dá)過程中的誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)時(shí)機(jī)，建立目標(biāo)重組蛋白誘導(dǎo)條件的數(shù)學(xué)模型，并預(yù)測和驗(yàn)證最佳的誘導(dǎo)條件，提高目的活性蛋白的表達(dá)水平.

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌種和質(zhì)粒：E.coliBL21 (DE3)是重組耐熱DERA的表達(dá)宿主，載體為pET303-DERA008，以T7為啟動(dòng)子，氨芐青霉素(Amp)作為篩選標(biāo)簽.該菌株于-80 ℃甘油保藏.

主要試劑：胰蛋白胨(Typtone)和酵母抽提物(Yeast extract)購自O(shè)XOID公司；2-脫氧-D-核糖-5磷酸(DRP)，磷酸丙糖異構(gòu)酶(Triose-phoshate isomerase)和甘油-3-磷酸脫氫酶(Glycerol-3-phosphate dehydrogenase)購自Sigma公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)、牛血清蛋白(BSA)、Amp和異丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)購自Genview公司；四甲基乙二胺(TEMED)購自Aldrich公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2 誘導(dǎo)表達(dá)

基因工程E.coli的甘油保藏液在含氨芐青霉素(1 mmol/L)的LB固體平板(含15 g/L瓊脂)上劃線，于37 ℃過夜培養(yǎng).挑取單克隆于5 mL液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃和200 rpm振蕩培養(yǎng)，當(dāng)OD600大于1.5時(shí)，此培養(yǎng)物作為誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的種子液.誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)在裝有100 mL液體LB培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中進(jìn)行，接種量為3%(v/v)，37 ℃振蕩培養(yǎng)至不同的菌體密度時(shí)添加不同量的IPTG.誘導(dǎo)溫度降為30 ℃，誘導(dǎo)時(shí)間為4 h.

1.3 純化方法

誘導(dǎo)結(jié)束后，于4 ℃條件下，5 000×g離心5 min收集細(xì)胞，重懸于磷酸緩沖液(0.1 M， pH 7.4)中，調(diào)整最終OD600約為8.細(xì)胞破碎采用超聲法(Sonicator 4000, MISONIX, USA)，程序設(shè)定為6 s開/6 s關(guān)，總時(shí)間為2 min.然后，11 270×g離心20 min取上清液作為粗酶液.耐熱DERA采用Ni柱親和層析進(jìn)行純化，操作按照純化手冊(cè)進(jìn)行(Ni-Sepharose HP， Amersham Biosciences， Freiburg，Germany).SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析酶蛋白表達(dá)和純化情況，分離膠濃度為15%.蛋白濃度采用Bradford法測定，以BSA(Bovine serum albumin)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白.

1.4 酶活力測定

DERA活力由DRP的分解活性確定，在Triose-phoshate isomerase和Glycerol-3-phosphate dehydrogenase的耦合作用下檢測NADH的氧化[8].1個(gè)酶活單位(U)定義為1 min氧化1 μmol NADH的酶量.

1.5 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析

表1 響應(yīng)面分析因子及水平Tab. 1 Experimental range and levels of the independent variables

綜合單因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用全因素3水平進(jìn)行設(shè)計(jì).每個(gè)因素設(shè)定為中心點(diǎn)(0)和高低水平(-1和+1)，13次實(shí)驗(yàn)用于優(yōu)化E.coli表達(dá)重組DERA的誘導(dǎo)條件 (表1和2).實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的多項(xiàng)回歸分析及數(shù)學(xué)模型的建立和評(píng)價(jià)由統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SAS?V8.02 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)完成.該實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行3次，結(jié)果以算術(shù)平均值加減標(biāo)準(zhǔn)偏差表示.

1.6 表達(dá)條件數(shù)學(xué)模型的建立和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

根據(jù)上述CCD實(shí)驗(yàn)的重組蛋白表達(dá)實(shí)際值計(jì)算數(shù)學(xué)模型中的變量編碼值，公式如下：

xi=(Ai-A0)/ΔA

(1)

A0是Ai中心點(diǎn)的真實(shí)值，ΔA是變量的極差.

再利用二次方程，構(gòu)建該研究中目標(biāo)蛋白表達(dá)和誘導(dǎo)條件優(yōu)化的數(shù)學(xué)模型，公式如下：

(2)

y為響應(yīng)值，xi和xj是變量的編碼值，β0，βi，βii，和βij是模型的回歸系數(shù)，分別表示常數(shù)項(xiàng)、線性、平方和乘積系數(shù).根據(jù)該模型計(jì)算獲得最佳表達(dá)條件的預(yù)測值進(jìn)行目標(biāo)重組蛋白的表達(dá)實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)預(yù)測的準(zhǔn)確性.

2 結(jié)果與討論

圖1 IPTG濃度對(duì)重組E. coli表達(dá)耐熱DERA的影響Fig. 1 The effect of IPTG concentration on expression of the recombinant thermophilic DERA in E. coli

2.1 IPTG濃度對(duì)重組DERA誘導(dǎo)表達(dá)的影響

由圖2可知，當(dāng)IPTG濃度為0.6 mM時(shí)，重組DERA的比活力達(dá)到最大值，即0.98 u/mg.當(dāng)IPTG濃度低于該值時(shí)，目標(biāo)蛋白的比活力下降；而高于該值時(shí)，比活力也沒有增加，基本維持在0.95 u/mg以上.細(xì)胞比生長速率表現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)，當(dāng)IPTG濃度低于0.6 mM時(shí)，該值變化較??；而高于此臨界點(diǎn)時(shí)，細(xì)胞比生長速率明顯下降.該現(xiàn)象可能與細(xì)胞攝取IPTG的方式有關(guān).乳糖透性酶(Lactose permease)參與IPTG的穿透細(xì)胞膜過程，且在較低濃度水平下可以被完全誘導(dǎo)[15].然而，在IPTG較高濃度下，其它非特異性途徑也被激活，部分抑制了細(xì)胞的生長[16].

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

在單因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，結(jié)合重組E.coli的生長情況，誘導(dǎo)時(shí)機(jī)分別設(shè)定為細(xì)胞對(duì)數(shù)生長的前期、中期和后期.響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)和結(jié)果如表2.1～9為析因?qū)嶒?yàn)，10～13為中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，用于估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差.根據(jù)表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過SAS軟件處理將各因素回歸擬合得到回歸方程，該實(shí)驗(yàn)的回歸方程為：

y為耐熱DERA的比活力，x1和x2為自變量誘導(dǎo)時(shí)機(jī)和IPTG濃度的編碼值.

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及重組DERA的生產(chǎn)Tab. 2 Three-level factorial RSM design according to two factors showing biomass and recombinant DERA production

a比活力定義為每毫克蛋白所具有的酶活力(u/mg)

2.3 回歸方程的方差分析

采用SAS對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA分析，結(jié)果見表3.該模型的R2值為92.8%，說明該回歸方程具有較好的擬合程度.P值為0.000 7，說明該模型對(duì)描述實(shí)驗(yàn)結(jié)果十分顯著.另外，失擬系數(shù)的P值為0.621，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上分析其影響不顯著(P>0.05)，說明該模型對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有較好的可預(yù)見性.同時(shí)由表3中的P值判斷，x1，x1x1和x2x2對(duì)y值的影響達(dá)到顯著水平，說明實(shí)驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系，且與二次項(xiàng)也有很大的關(guān)系，而交互作用的影響相對(duì)較小.

表3 重組DERA優(yōu)化模型的回歸分析Tab. 3 Results of regression analysis of a full second-order polynomial model for optimization of recombinant DERA production

2.4 響應(yīng)面直觀分析

圖2直觀地顯示了IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)目標(biāo)蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的交互作用.在實(shí)驗(yàn)中所選的范圍內(nèi)存在最大值，及相應(yīng)面的最高點(diǎn)，同時(shí)也是等值線最小橢圓的中心點(diǎn)，而該點(diǎn)處于誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的低水平附近，這與實(shí)際實(shí)驗(yàn)過程相互吻合，即在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期的初期進(jìn)行誘導(dǎo)有利于目標(biāo)蛋白的活性表達(dá).

圖2 IPTG和誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)重組DERA表達(dá)影響的響應(yīng)面和等值線圖Fig. 2 Response surface plot of specific activity (u/mg) as a function of biomass at the time of induction (OD) and inducer (IPTG) concentration (mM)

1：Protein MW Marker (TaKaRa)；2：BL21(DE3)原始菌株；3：BL21(pET303-DERA008)未誘導(dǎo)；4：BL21(pET303-DERA008)IPTG誘導(dǎo)；5：誘導(dǎo)表達(dá)后總上清蛋白；6：Ni-柱純化后的目的蛋白DERA圖3 耐熱DERA在最佳誘導(dǎo)條件下的表達(dá)和純化Fig. 3 Expression and purification of the recombinant thermophilic DERA under optimized conditions

2.5 最佳誘導(dǎo)條件的確定

由SAS軟件分析得到最大響應(yīng)值，其對(duì)應(yīng)的最佳誘導(dǎo)條件：誘導(dǎo)時(shí)機(jī)(OD)和IPTG濃度分別為0.76和0.57 mM，理論最佳DERA的比活力為1.124 u/mg.為了驗(yàn)證該模型預(yù)測的最佳條件，3次平行實(shí)驗(yàn)得到的實(shí)際平均耐熱DERA活力為1.178 u/mg，與理論值相當(dāng)，進(jìn)一步說明該方程與實(shí)際情況具有較好的擬合度，驗(yàn)證了該模型的正確性.目標(biāo)蛋白的表達(dá)與純化如圖3.

3 結(jié) 論

文章采用響應(yīng)面法優(yōu)化了E.coliBL21 (pET303-DERA008)表達(dá)耐熱DERA的誘導(dǎo)條件，利用SAS軟件建立了提高該酶表達(dá)的二次多項(xiàng)式模型，確定最佳工藝條件為：IPTG濃度0.57 mM，誘導(dǎo)時(shí)機(jī)OD600為0.76，理論最佳DERA的比活力為1.124 u/mg，實(shí)際平均比活力為1.178 u/mg，兩者幾乎相等.該方法有效優(yōu)化了目標(biāo)重組蛋白的誘導(dǎo)條件，同時(shí)也為該工程酶的中試發(fā)酵提供重要的參考依據(jù).

[1] Dean S M, Greenberg W A, Wong C H. Recent Advances in Aldolase Catalyzed Asymmetric Synthesis [J]. Adv Synth Catal,2007,349(8/9):1308-1320.

[2] Chen L, Dumas D P, Wong C H. Deoxyribose-5-phosphate Aldolase as a Catalyst in Asymmetric Aldol Condensation [J]. J Am Chem Soc,1992,114(2):741-748.

[3] Wong C H, Garcia-Junceda E, Chen L,etal. Recombinant 2-Deoxyribose-5-phosphate Aldolase in Organic Synthesis Using of Sequential Two-substrate and Three-substrate Aldol Reactions[J]. J Am Chem Soc,1995,117(12):3333-3339.

[4] Samland A K, Sprenger G A. Microbial Aldolases as C-C Bonding Enzymes-Unknown Treasures and New Developments[J]. Appl Microbiol. Biotehnol,2006,71(3):253-264.

[5] Machajewski T D, Wong C H. The Catalytic Asymmetric Aldol Reaction[J]. Angew Chem Int Ed,2000,39(8):1352-1374.

[6] Groth D P. Deoxyribose 5-phosphate Aldolase[J]. J Biol Chem,1967,242(1):155-159.

[7] Sakuraba H, Tsuge H, Shimoya I,etal. The First Crystal Structure of Archaeal Aldolase[J]. J Biol Chem,2003,278(12):10799-10806.

[8] Sakuraba H, Yoneda K, Yoshihara K,etal. Sequential Aldol Condensation Catalyzed by Hyperthermophilic 2-Deoxy-D-Ribose-5-Phosphate Aldolase [J]. Appl Environ Microb,2007,73(22):7427-7434.

[9] Wang Qiuyan, Chen Rong, Du Pengfei,etal. Cloning and Characterization of Thermostable-deoxy-D-ribose-5-phosphate Aldolase fromHyperthermusbutylicus[J]. Afr J Biotechnol,2010,9(20):2898-2905.

[10] 李誠璐,杜鵬飛,裴曉林，等.嗜熱微生物中獲取耐乙醛變形醛縮酶[J].杭州師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2010，9(5):373-378.

[11] Vidal L, Ferrer P,lvaro G,etal. Influence of Induction and Operation Mode on Recombinant Rhamnulose 1-Phosphate Aldolase Production byEscherichiacoliUsing the T5 Promoter[J]. J Biotechnol,2005,118(1):75-87.

[12] Tabandeh F, Khodabandeh M, Yakhchali B,etal. Response Surface Methodology for Optimizing the Induction Conditions of Recombinant Interferon Beta During High Cell Density Culture[J]. Chem Eng Sci,2008,63:2477-2483.

[13] Choi J H, Keum K C, Lee S Y. Production of Recombinant Proteins by High Cell Density Culture ofEscherichiacoli[J]. Chem Eng Sci,2006,61:876-885.

[14] Faven D D, Torre P, Aliakbarian B,etal. Response Surface Modeling of Vanillin Production byEscherichiacoliJM109pBB1[J]. Biochem Eng J,2007,36(3):268-275.

[15] Jensen P R, Westerhoff H V, Michelsen O. The Use oflac-type Promoters in Control Analysis[J]. Eur J Biochem,1993,211(1-2):181-191.

[16] Pinsach J, de Mas C, Lopez-Santin J. Induction Strategies in Fed-batch Cultures for Recombinant Protein Production inEscherichiacoli: Application to Rhamnulose 1-Phosphate Aldolase[J]. Biochem Eng J,2008,41(2):181-187.

ResponseSurfaceOptimizationforInductionConditionsonExpressionoftheThermophilicAldolasefromHyperthermusbutylicusinEscherichiacoli

PEI Xiao-lin, LI Cheng-lu, Wang Qiu-yan, XIE Kai-lin, FU Chen-lu, ZHANG Yong, XIE Tian

(Center for Biomedicine and Health, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310012, China)

In order to improve the expression level of a recombinant thermophilic 2-Deoxyribose-5-phophate aldolase, the paper optimized the induction conditions inE.coilby the response surface methodology based on the central composite design. The factors included inducer concentration (mM, isopropyl β-D-thiogalactopyranoside, IPTG) and cell density (g/L) at the time of induction. The results show that this method can increase the expression quantity of protein, and determine the best induction condition, that is when IPIG density is 0.57 mG, and OD600is 0.76. The maximal DERA specific activity was 1.124 μ/mg which is nearly equal to the actual specific activity that is 1.178 u/mg, this result indicates that the model corresponds with the actual sistuation.

2-deoxyribose-5-phophate aldolase; response surface methodology; central composite design; induction condition;Escherichiacoli

10.3969/j.issn.1674-232X.2011.02.013

2010-11-01

浙江省科技廳重大項(xiàng)目(2007C01004-2).

裴曉林(1980—)，男，山西運(yùn)城人，研究實(shí)習(xí)員，碩士，主要從事生物化工研究.E-mail: pxl@hznu.edu.cn

*通信作者：謝 恬(1961—)，男，浙江武義人，副教授，博士，主要從事中藥與天然藥物研發(fā).E-mail: tianxie@hznu.edu.cn

Q819

A

1674-232X(2011)02-0153-05