王 瑞，展曉日，杜曉清，曾昭武

(1.山西中醫(yī)學(xué)院中藥系，山西 太原 030024;2.杭州師范大學(xué)生物醫(yī)藥與健康中心，浙江 杭州 310012)

TLC測定白芍配伍前后芍藥苷的含量變化研究

王 瑞1，展曉日2*，杜曉清1，曾昭武2

(1.山西中醫(yī)學(xué)院中藥系，山西 太原 030024;2.杭州師范大學(xué)生物醫(yī)藥與健康中心，浙江 杭州 310012)

采用薄層掃描法測定白芍配伍前后芍藥苷的含量，展開劑為三氯甲烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶氨試液(8∶1∶4∶1)，檢測波長575 nm，參比波長700 nm.比較白芍單煎液和小建中湯復(fù)方煎液中芍藥苷的含量變化，探討小建中湯配伍的合理性.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該方法的精密度、穩(wěn)定性和準確度良好，芍藥苷在1.93～19.3 μg范圍內(nèi)線性良好，白芍單煎液和復(fù)方煎液的方法回收率分別為98.3%和95.9%，單煎液中芍藥苷的含量明顯低于復(fù)方煎液(P<0.01).表明白芍在小建中湯中配伍可以增加有效成分芍藥苷的煎出量.

小建中湯；配伍；芍藥苷；含量測定；薄層掃描法

小建中湯首見于《傷寒論》，由飴糖、白芍、大棗、桂枝、甘草(蜜炙)、生姜6味中藥組成，具有溫中補虛、和里緩急之功效[1-2].用于治療中焦虛寒，氣血不足之癥兼?zhèn)碚?，以及治脾虛腹痛兼少陽邪郁?方中重用甘溫質(zhì)潤之飴糖為君，溫補中焦，緩急止痛.臣以辛溫之桂枝溫陽氣，驅(qū)寒邪；酸甘之白芍養(yǎng)營陰，緩肝急，止腹痛.佐以生姜溫胃散寒，大棗補脾益氣.六藥合用，溫中補虛緩急之中，蘊有柔肝理脾，益陰和陽之意，用之可使中氣強健，陰陽氣血生化有緣，故以“建中”名之[3].該研究將中成藥白芍的主要有效成分芍藥苷作為含量測定的指標成分，通過薄層掃描法測定配伍前后白芍藥材以及小建中湯中芍藥苷的含量變化，探討小建中湯配伍的合理性.

1 儀器與試藥

SCANNER-3型薄層掃描儀(瑞士 CAMAG公司)，METTLER(梅特勒)-AB135-S十萬分之一電子分析天平，F(xiàn)A/JA1004型萬分之一電子天平；芍藥苷對照品(批號：0715-200211.含量測定用，純度>98%，中國藥品生物制品檢定所).白芍、桂枝、甘草(蜜炙)均購自同仁堂藥店，經(jīng)山西中醫(yī)學(xué)院裴香萍副教授鑒定，符合《中國藥典》2010年版規(guī)定.大棗，生姜，飴糖均為市售.

乙醚，正丁醇，石油醚(60～90 ℃)，乙酸乙酯，三氯甲烷，甲醇，濃氨試液，甲酸，冰醋酸等均為分析純.

2 方法和結(jié)果

2.1 薄層色譜條件

SCANNER-3型薄層掃描儀，在λS=575 nm，λR=700 nm下掃描.

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取芍藥苷對照品適量，用甲醇溶解制成每毫升含有芍藥苷1.93 mg的對照品溶液.

2.2.2 小建中湯樣品溶液的制備 稱量生姜4.5 g，桂枝4.5 g，炙甘草3.0 g，大棗4.5 g(約2枚，去核)，白芍9.0 g于500 mL的燒杯里，向其中加10倍量水(255 mL)，浸泡30 min，第一次煎煮30 min，紗布過濾，濾渣和紗布一起用8倍量水204 mL再次煎煮20 min，和前一次濾液一起減壓抽濾得濾液，加入飴糖15 g烊化，濃縮至50 mL左右，離心，離心液定容至100 mL.移取20 mL，用乙醚振搖提取3次，每次15 mL，棄去乙醚液，再用水飽和正丁醇振搖提取4次，每次15 mL，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的水40 mL洗滌，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 mL溶解，作為供試液.

2.2.3 白芍藥材溶液的制備 稱取白芍藥材9.0 g于500 mL的燒杯里，向其中加入255 mL水，按照“2.2.2”項方法制備，得白芍樣品溶液.

2.2.4 陰性樣品溶液的制備 稱取“2.2.2”項除白芍外的其他藥材，按相同的方法制備，得缺白芍的陰性對照溶液.

3 芍藥苷配伍前后含量測定

3.1 方法學(xué)考察[4-8,11]

3.1.1 標準曲線制備 取芍藥苷對照品1，2，4，6，8，10 μL，照薄層色譜法(附錄VIB)試驗，分別交叉點于同一于羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以三氯甲烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶濃氨試液(8∶1∶4∶1)為展開劑展開、取出、晾干，噴以5% 香草醛硫酸試液，加熱至斑點顯色清晰[9-10].按照“2.1”項色譜條件掃描，以峰面積Y對進樣量X(μg)進行回歸處理，得到芍藥苷的回歸方程為：Y=938.73X+286.36，r=0.997.芍藥苷的線性范圍為1.93～19.3 μg.

3.1.2 精密度實驗 取芍藥苷對照品，在同一塊薄層板上點6個點，均點樣4 μL，照薄層色譜法(附錄VIB)[12]試驗，以三氯甲烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶濃氨試液(8∶1∶4∶1)為展開劑展開、取出、晾干，噴以5%香草醛硫酸試液，加熱至斑點顯色清晰.按照“2.1”項色譜條件掃描，其峰面積的RSD=1.8%，表明儀器精密度良好.

3.1.3 穩(wěn)定性實驗 按處方精密稱取生姜4.5 g，桂枝4.5 g，炙甘草3.0 g，大棗4.5 g(去核)，白芍9.0 g，按“2.2.2”項方法制備小建中湯供試品溶液，放置0，3，6，9，12，24 h后，按上述色譜條件進行TLC分析，每次點樣4 μL，測定峰面積，計算芍藥苷含量.芍藥苷含量的RSD=2.8% ，表明芍藥苷在24 h內(nèi)穩(wěn)定.

3.1.4 重復(fù)性實驗 按小建中湯處方量(生姜4.5 g，桂枝4.5 g，炙甘草3.0 g，大棗4.5 g(去核)，白芍9.0 g)精密稱取6份，照“2.2.2”項方法制備，得小建中湯樣品溶液1，2，3，4，5，6.稱取白芍藥材6份，每份9.0 g，精密稱定，同法制得白芍樣品溶液1，2，3，4，5，6.分別精密吸取上述溶液4 μL，依法測定，測得小建中湯樣品溶液中芍藥苷含量的RSD=3.1%，白芍供試液中芍藥苷含量的RSD=3.6%.

3.1.5 加樣回收率實驗 取芍藥苷對照品20 mg，精密稱定，溶于甲醇中，制成濃度為10 mg·mL-1芍藥苷對照品溶液.稱取白芍藥材6份，每份4.5 g，精密稱定，均加入上述對照品溶液0.3 mL，按照“2.2.2”項方法制備，作為白芍加樣回收率實驗供試品溶液.按小建中湯處方量(白芍減半)(生姜4.5 g，桂枝4.5 g，炙甘草3.0 g，大棗4.5 g(去核)，白芍4.5g)稱取6份，精密稱定，均加入上述對照品溶液0.4 mL，按照“2.2.2”項方法制備，作為小建中湯加樣回收率實驗供試品溶液.

移取上述供試品溶液各4 μL，對照品溶液4 μL，交叉點于同一硅膠G薄層板上，按照“2.1”項色譜條件掃描，測得白芍中芍藥苷的平均回收率98.3%，RSD為2.6%，小建中湯中芍藥苷的平均回收率為95.9%，RSD為2.3%.

3.1.6 陰性干擾實驗 移取白芍藥材溶液4 μL，陰性樣品溶液4 μL，芍藥苷對照品溶液4 μL，交叉點于同一硅膠G薄層板上，按照“3.1.1”項薄層色譜展開劑條件展開、取出、晾干，噴以5%香草醛硫酸試液，加熱至斑點顯色清晰.白芍藥材溶液在與對照品相同的位置顯示相同顏色的斑點，陰性樣品溶液在與對照品相同的位置沒有斑點，不干擾樣品的測定.

3.2 芍藥苷的含量測定

分別取白芍藥材供試液4 μL，小建中湯供試液4 μL，芍藥苷的對照品4 μL和6 μL(濃度為1.93 mg·mL-1).照薄層色譜法(附錄VIB)試驗，分別交叉點于同一羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以三氯甲烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶濃氨試液(8∶1∶4∶1)為展開劑展開、取出、晾干，噴以5%香草醛硫酸試液，加熱至斑點顯色清晰.供試品色譜在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點.按照“2.1”項色譜條件掃描，結(jié)果見表1.

表1 芍藥苷的含量測定結(jié)果Tab. 1 Determination results of paeoniflorin

表1中含量為折合成藥材中芍藥苷的含量.由表1可知小建中湯中芍藥苷的含量顯著大于白芍煎液中芍藥苷的含量(n=6，P<0.01)，故小建中湯配伍后對白芍中的藥效成分芍藥苷具有助溶作用，配伍有助于藥效成分的溶出.

4 討論與小結(jié)

多味中藥依其配伍原則組合在一起，經(jīng)過制劑后，其化學(xué)成分變得非常復(fù)雜，蛋白類、多糖類等生物大分子與萜類、黃酮類、苷類等成分同時存在于煎液中，為分離測定帶來許多不便.為此，筆者分別采用抽濾、溶劑萃取等方法，對樣品液進行預(yù)處理，使待測液中雜質(zhì)相對減少，薄層色譜鑒別顯色清晰.

煎煮時間的長短，對其成分的煎出量均有較大的影響，芍藥苷在開始時，煎出量較低，隨時間延長而增加，煎出量達到峰值，而后隨時間延長則下降.該研究考察了煎煮時間，確定為第一煎30 min，第二煎20 min.

芍藥苷為籠狀烷骨架的單萜，易溶解于極性溶劑，故采用水煎煮提取，水飽和正丁醇萃取，正丁醇飽和水洗去極性較大的雜質(zhì)，正丁醇萃取溶液蒸干后，用甲醇溶解點樣.湯劑中甘草酸有利于芍藥苷的溶出，增加了煎液中芍藥苷的含量，故小建中湯中芍藥苷含量較白芍藥材中大一些.

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[12]衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：附錄34.

DeterminationonContentDifferenceofPaeoniflorinbeforeandafterRadixPaeoniaeAlbaCompatibilitybyTLCS

WANG Rui1, ZHAN Xiao-ri2, DU Xiao-qing1, ZENG Zhao-wu2

(1. Department of Chinese Herb, Shanxi College of Traditional Chinese Medicine, Taiyuan 030024, China; 2. Center of Biomedicine and Health, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310012, China)

The experiment determined the content of paeoniflorin before and after Radix Paeoniae Alba compatibility by TLCS with chloroform, ethyl acetate, methanol, ammonia (8∶1∶4∶1) as developing agents, and the detection wavelength was 575 nm, reference wavelength was 700 nm. Comparing the content difference of paeoniflorin in Radix Paeoniae Alba single decoction and Xiaojianzhong compound decoction, the paper discussed the rationality of Xiaojianzhong decoction compatibility. The results show that the precision, stability and accuracy of the method are good, the linearity of paeoniflorin is good in the range of 1.93～19.3 μg, the percent recovery of paeoniflorin in Radix Paeoniae Alba single decoction and Xiaojianzhong compound decoction is 98.3% and 95.9% respectively, the content of paeoniflorin is lower in single decoction than that in compound decoction (n=6,P<0.01), so that it is considered that the content of paeoniflorin can be increased by the compatibility of Radix Paeoniae Alba in Xiaojianzhong decoction.

Xiaojianzhong decoction; compatibility; paeoniflorin; content determination; TLCS

10.3969/j.issn.1674-232X.2011.02.010

2010-11-01

國家自然科學(xué)青年基金項目(81001647)；浙江省科技廳面上項目(2009C33005)；中國博士后科學(xué)基金面上項目(20100471757).

王 瑞(1978—)，女，河南駐馬店人，講師，博士,主要從事中藥質(zhì)量控制與體內(nèi)代謝研究.E-mail: wrgreentea@163.com

*通信作者：展曉日(1980—)，女，山東萊西人，助理研究員，博士,主要從事中藥新藥及質(zhì)量控制研究.E-mail: cortex@163.com

R284.1

A

1674-232X(2011)02-0137-04