張生潭，張帆，汪鐵山，林敬明#（.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院藥劑科，廣州市508；.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院皮膚科，廣州市 508）

正交試驗(yàn)優(yōu)選春砂仁揮發(fā)油羥丙基-β-環(huán)糊精包合工藝Δ

張生潭1＊，張帆2，汪鐵山1，林敬明1#（1.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院藥劑科，廣州市510282；2.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院皮膚科，廣州市 510282）

目的：研究羥丙基-β-環(huán)糊精（HP-β-CD）包合春砂仁揮發(fā)油的最佳工藝，并進(jìn)行包合物鑒定。方法：以揮發(fā)油利用率、包合物含油率與最高含油率比值和包合物收率的綜合得分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)攪拌法、超聲法和研磨法進(jìn)行優(yōu)選；以揮發(fā)油與HP-β-CD的投料比、HP-β-CD的濃度、包合時(shí)間、包合溫度為考察因素，上述綜合得分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)選最佳包合工藝，并通過(guò)顯微鑒別、差示掃描量熱分析、紫外分光光度、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用等方法對(duì)包合前、后的包合物進(jìn)行鑒別。結(jié)果：最佳包合方法為超聲法，最佳包合工藝條件為揮發(fā)油與HP-β-CD的投料比為1∶10（V∶m），HP-β-CD的濃度為40%，包合時(shí)間80min，包合溫度55℃。包合前、后成分未見(jiàn)明顯變化。結(jié)論：春砂仁揮發(fā)油的HP-β-CD包合工藝切實(shí)可行，可為實(shí)際生產(chǎn)研究提供一定的試驗(yàn)依據(jù)。

春砂仁；揮發(fā)油；羥丙基-β-環(huán)糊精；包合物；制備工藝

砂仁是姜科植物陽(yáng)春砂Amomurn villosum Lour、綠殼砂A.villosum Lour.Var.xanthioides T.L.Wu et Senjen或海南砂A.Iongiligulare T.L.Wu的干燥成熟果實(shí)[1]。其中以廣東陽(yáng)春產(chǎn)的春砂仁質(zhì)量為最佳。主治腹痛痞脹、胃呆食滯、噎膈嘔吐、寒瀉冷痢，是臨床常用中藥之一，也是中國(guó)著名的四大南藥之一?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，砂仁揮發(fā)油具有促進(jìn)胃腸機(jī)能、促進(jìn)消化液分泌[2]、抗炎、鎮(zhèn)痛[3]、免疫調(diào)節(jié)[4]、抗動(dòng)脈血栓及抗凝血作用[5]，但容易受到光、空氣、溫度等因素影響而使含揮發(fā)油制劑的質(zhì)量及療效降低。因此，有必要選擇合適的輔料制備成合適的劑型，以減少揮發(fā)油在生產(chǎn)、貯存過(guò)程的揮發(fā)及氧化變質(zhì)。環(huán)糊精（CD）作為新型的藥物輔料，其獨(dú)特的環(huán)狀中空結(jié)構(gòu)具有一定的藥物包合能力，各種類型的β-CD可以提高藥物的溶解度[6]，并可促進(jìn)生物膜對(duì)藥物的吸收，降低藥物對(duì)生物膜刺激性等[7]。因此，本試驗(yàn)采用羥丙基（HP）-β-CD為包合材料，采用冷凍干燥法制備包合物，并以包合物綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行包合工藝優(yōu)選[8]，對(duì)春砂仁揮發(fā)油進(jìn)行包合，以使揮發(fā)油與外界環(huán)境隔離，從而提高藥物的穩(wěn)定性、藥理作用及生物利用度[9]。

1 儀器與試藥

HP6890/5973型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）儀（美國(guó)Agilent公司）；PE lambda-35型紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Perkin Elmer公司）；DSC 204型差示掃描量熱儀（德國(guó)Netzsch公司）；LaBconco freezone 6型冷凍干燥機(jī)（美國(guó)LaBconco公司）；BL-2000S型電子天平（美國(guó)Serea公司）；KQ-600DE型數(shù)控超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；TC-15型電熱恒溫器（海寧市新華醫(yī)療器械廠）；JB50-D型電磁攪拌器（上海標(biāo)本模型廠）。

CAVASOL?W7型HP-β-CD（美國(guó)Wacker化學(xué)公司）；春砂仁飲片（廣州市藥材公司中藥飲片廠，批號(hào)：20090601）；石油醚、無(wú)水乙醇、乙醚等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油的提取

春砂仁去殼，粉碎，過(guò)2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)篩網(wǎng)。稱取適量藥材粉末，置于蒸餾燒瓶中，加5倍量蒸餾水及玻璃珠數(shù)粒，浸泡過(guò)夜，按2005年版《中國(guó)藥典》項(xiàng)下方法[1]提取6h，得到的揮發(fā)油用無(wú)水硫酸鈉脫水，乙醚洗滌揮發(fā)油提取器，低溫下?lián)]去乙醚，得干燥的揮發(fā)油（為淡黃色油狀液體），平行提取6次，春砂仁平均含油率為3.57%（mL·g-1）。揮發(fā)油置于陰涼干燥處避光保存，備用。

2.2 包合方法的選擇

包合物的制備方法常有攪拌法、超聲法和研磨法，本試驗(yàn)分別采用3種包合方法對(duì)揮發(fā)油進(jìn)行包合，以包合物綜合得分為指標(biāo)優(yōu)選最佳包合方法。

2.2.1 攪拌法 取HP-β-CD適量，置于100mL三頸燒瓶中，加適量蒸餾水配成40%的HP-β-CD水溶液，于磁力攪拌器中40℃下緩慢加入“2.1”項(xiàng)下制備的揮發(fā)油的無(wú)水乙醇溶液（揮發(fā)油∶乙醇＝1∶2，V/V），攪拌至規(guī)定時(shí)間后取出，用石油醚洗滌3次（每次5mL），除去未被包合的揮發(fā)油，冷凍結(jié)冰，置于冷凍干燥機(jī)中干燥（冷凍干燥條件：－50℃，0.09MPa，12h），即得干燥包合物，取出，置于干燥器中保存，備用。

2.2.2 超聲法 取HP-β-CD適量，置于100mL具塞三角瓶中，加適量蒸餾水配成40%的HP-β-CD水溶液，于超聲清洗儀中40℃下緩慢加入“2.1”項(xiàng)下制備的揮發(fā)油的無(wú)水乙醇溶液（揮發(fā)油∶乙醇＝1∶2，V/V），超聲包合至規(guī)定時(shí)間后以下操作同“2.2.1”項(xiàng)下方法。

2.2.3 研磨法 取HP-β-CD適量，置于研缽中，加適量蒸餾水配成40%的HP-β-CD水溶液，于40℃條件下，邊研磨邊緩慢加入“2.1”項(xiàng)下制備的揮發(fā)油的無(wú)水乙醇溶液（揮發(fā)油∶乙醇＝1∶2，V/V），研磨至規(guī)定時(shí)間后以下操作同“2.2.1”項(xiàng)下方法。

2.2.4 空白回收率的測(cè)定 精密量取春砂仁揮發(fā)油1.00mL，置于1000mL圓底燒瓶中，加200mL蒸餾水、沸石幾粒，按2005年版《中國(guó)藥典》項(xiàng)下方法[1]提取，得到的揮發(fā)油用無(wú)水硫酸鈉脫水，乙醚洗滌揮發(fā)油提取器，低溫下?lián)]去乙醚，稱量，平行6次試驗(yàn)，并按下式計(jì)算空白回收率：空白回收率（%）＝回收揮發(fā)油量（mL）/揮發(fā)油加入量（mL）。結(jié)果，揮發(fā)油的平均空白回收率為94.5%。

2.2.5 包合物綜合得分的計(jì)算 包合物綜合得分＝包合物收率×20+（包合物含油率/最高含油率）×30+揮發(fā)油利用率×50；最高含油率（%）＝揮發(fā)油投入量（mL）/（HP-β-CD投入量+揮發(fā)油投入量）（g）×100%；包合物收率（%）＝包合物收得量（g）/（HP-β-CD投入量+揮發(fā)油投入量）（g）×100%；揮發(fā)油利用率（%）＝包合物含油量（mL）/（揮發(fā)油投入量（mL）×空白回收率）×100%；包合物含油率（%）＝包合物含油量（mL）/（包合物重量（g）×空白回收率）×100%。以包合物綜合得分為指標(biāo)，評(píng)價(jià)包合方法。結(jié)果，超聲法制備包合物的綜合得分相對(duì)較高，故采用超聲法制備包合物。3種包合方法的比較見(jiàn)表1。

2.3 包合物制備工藝的選擇

2.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，確定了對(duì)包合工藝影響較大的揮發(fā)油與HP-β-CD的比例（A）、HP-β-CD的濃度（B）、包合時(shí)間（C）和包合溫度（D）為考察因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，以揮發(fā)油利用率、包合物含油率與最高含油率比值、包合物收率及其綜合得分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)。因素水平見(jiàn)表2。

表1 3種包合方法的比較Tab 1 Comparison of 3kinds of inclusion methods

表2 因素水平Tab 2 Factors and levels

2.3.2 試驗(yàn)結(jié)果 包合物按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，試驗(yàn)因素水平照L9（34）正交表設(shè)計(jì)安排。包合物制備并干燥后，精密稱量。并精密稱取干燥包合物適量，置于1000mL圓底燒瓶中，加200mL蒸餾水，按2005年版《中國(guó)藥典》項(xiàng)下方法[1]提取，得到的揮發(fā)油用無(wú)水硫酸鈉脫水，乙醚洗滌揮發(fā)油提取器，低溫下?lián)]去乙醚，得干燥的揮發(fā)油，按“2.2.5”項(xiàng)下公式計(jì)算包合物收率、包合物含油率與最高含油率的比值、揮發(fā)油利用率及其綜合得分，以此為指標(biāo)分析正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3；方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Results of orthogonal experiment

表4 方差分析結(jié)果Tab 4 Results of variance analysis

從表3、表4可知，各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響程度為A＞C＞B＞D，因素A、C對(duì)包合工藝具有顯著性影響，最佳包合工藝為A2B2C3D2，即揮發(fā)油∶HP-β-CD＝1∶10（V∶m），HP-β-CD濃度為40%，包合時(shí)間為80min，包合溫度為55℃。2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 取HP-β-CD 3份，按優(yōu)選出的最佳工藝條件進(jìn)行包合并測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。結(jié)果，其包合物平均收率為92.8%，揮發(fā)油含油率與最高含油率的平均比值為84.5，揮發(fā)油平均利用率為79.4%，綜合評(píng)分為83.61，與正交試驗(yàn)結(jié)果相近，表明包合工藝穩(wěn)定、可行。

3 包合物鑒定

3.1 顯微鑒別

分別取HP-β-CD、揮發(fā)油包合物，于光學(xué)顯微鏡下觀察。結(jié)果，HP-β-CD呈近透明晶體狀，包合物為不透明團(tuán)狀物質(zhì)，表觀形態(tài)發(fā)生變化，表明包合物初步形成。顯微鑒別見(jiàn)圖1。

圖1 顯微鑒別（×40）A.包合前；B.包合后Fig 1 Microscopic identification（×40）A.before inclusion；B.after inclusion

3.2 差示掃描量熱分析（DSC）鑒別

取HP-β-CD、揮發(fā)油與HP-β-CD物理混合物、揮發(fā)油包合物，置于DSC 204差示掃描量熱儀中進(jìn)行測(cè)定，記錄升溫曲線。結(jié)果，由DSC曲線可看出，HP-β-CD揮發(fā)油物理混合物與HP-β-CD比較，在119℃附近有一較寬的吸熱峰，而包合物在此無(wú)吸熱峰出現(xiàn)；包合物在274℃附近出現(xiàn)一個(gè)較寬的新的吸熱峰，與物理混合物的DSC曲線有別，表明揮發(fā)油與HP-β-CD形成了新的物相，可判斷包合物基本形成。差示掃描量熱分析圖見(jiàn)圖2。

圖2 差示掃描量熱分析圖A.空白HP-β-CD；B.HP-β-CD與揮發(fā)油物理混合物；C.揮發(fā)油包合物Fig 2 DSCA.blank HP-β-CD；B.physical mixture of HP-β-CD with volatile oil；C.inclusion complex of volatile oil

3.3 紫外分光光度法鑒別

分別制備樣品①揮發(fā)油甲醇溶液、②包合物甲醇溶液、③包合物末次洗滌液、④HP-β-CD甲醇溶液，于紫外分光光度計(jì)中在200～450nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。結(jié)果，包合物末次洗滌液只有微弱吸收，說(shuō)明未被包合的揮發(fā)油基本洗滌干凈，包合物與揮發(fā)油的吸收?qǐng)D譜基本相同，表明包合物形成過(guò)程為一物理包合過(guò)程，未與HP-β-CD發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，包合物基本形成。紫外吸收光譜見(jiàn)圖3。

圖3 紫外吸收光譜①.揮發(fā)油甲醇溶液；②.包合物甲醇溶液；③.包合物末次洗滌液；④.HP-β-CD甲醇溶液Fig 3 UV absorption spectrum①.methanol solution of essential oil；②.methanol solution of inclusion complex；③.last washing liquid of inclusion complex；④.methanol solution of HP-β-CD

3.4 GC-MS法鑒別

取春砂仁包合前揮發(fā)油、包合物中提取的揮發(fā)油各適量，置于GC-MS儀中檢測(cè)。結(jié)果，從總離子流圖可看出，揮發(fā)油包合前、后的成分基本沒(méi)有發(fā)生變化，表明HP-β-CD可對(duì)春砂仁揮發(fā)油成分進(jìn)行全面包合，保證了揮發(fā)油成分包合前、后的穩(wěn)定，保持了揮發(fā)油的天然活性?？傠x子流圖見(jiàn)圖4。

圖4 總離子流圖A.包合前；B.包合后Fig 4 Total ion currentA.before inclusion；B.after inclusion

4 討論

本研究采用綜合評(píng)分系統(tǒng)對(duì)包合工藝進(jìn)行評(píng)價(jià)，考慮到揮發(fā)油的包合率在實(shí)際生產(chǎn)中對(duì)制劑的質(zhì)量及療效的影響較大，故其權(quán)重系數(shù)定為50，而包合物收率和包合物的含油率與最高含油率比值為實(shí)際生產(chǎn)中需重要考慮的因素，故其權(quán)重系數(shù)分別定為20、30。以此綜合得分來(lái)評(píng)價(jià)包合工藝的優(yōu)劣，可較全面地評(píng)價(jià)包合物的制備工藝，對(duì)實(shí)際生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義。顯微鑒別和DSC曲線顯示，春砂仁揮發(fā)油包合物與HP-β-CD及其物理混合物的物相相比均不相同，說(shuō)明包合物形成了一種新的物相，初步證明揮發(fā)油與HP-β-CD形成了包合物；揮發(fā)油由液體變?yōu)榘衔锕腆w，紫外吸收?qǐng)D譜顯示，揮發(fā)油與HP-β-CD形成包合物過(guò)程中，未發(fā)生化學(xué)變化，包合過(guò)程屬于物理包合過(guò)程；總離子流圖顯示，包合物前、后揮發(fā)油成分未發(fā)生顯著變化，既保持了春砂仁揮發(fā)油的天然特性，又達(dá)到了提高藥物穩(wěn)定性的目的。同時(shí)，本試驗(yàn)采用HP-β-CD作為包合材料，大大增加了揮發(fā)油的水溶性，藥物由液態(tài)變?yōu)楣虘B(tài)，提高了藥物的穩(wěn)定性并利于制成多種劑型，進(jìn)而提高患者的順應(yīng)性。采用冷凍干燥技術(shù)制備的的包合物也可制成注射用無(wú)菌粉末，增加藥物的給藥途徑，有利于提高其生物利用度。藥物分子進(jìn)入到CD的骨架當(dāng)中，可使制劑具有緩釋作用[10]，從而減少用藥次數(shù)，降低藥物毒副作用，同時(shí)增加患者用藥的順應(yīng)性。但在包合過(guò)程中，應(yīng)注意超聲時(shí)間及包合溫度的選擇與控制，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或溫度過(guò)高，都可能造成揮發(fā)油從包合物中重新釋放出來(lái)，從而降低包合率和含油率等，影響包合效果。

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Optimization of the Preparation Technology of Amomum villous Oil-hydroxypropyl-β-Cyclodextrin Inclusion Complex by Orthogonal Experiment

ZHANG Sheng-tan,WANG Tie-shan,LIN Jing-ming（Dept.of Pharmacy,Zhujiang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510282,China）

ZHANG Fan（Dept.of Dermatology,Zhujiang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510282,China）

OBJECTIVE：Tooptimizethepreparationtechnologyof Amomum villousoil-hydroxypropyl-β-cyclodextrin（HP-β-CD）inclusion complex,and to identify the inclusion complex.METHODS：With the utilization ratio of volatile oil，ratio of oil content to the highest oil content and yield of inclusion complex as index,the stirring method,ultrasonic method and trituration method were optimized.The preparation technology of inclusion complex was optimized by orthogonal experiment taking the comprehensive evaluation score as index with ratio of volatile oil to HP-β-CD,concentration of HP-β-CD,inclusion time and inclusion temperature as factors.Microscopic identification method,DSC method，UV method and GC-MS method were used for the identification of inclusion complex.RESULTS：Ultrasonic method was the best preparation method,and the optimal preparation condition as following：the ratio of volatile oil to HP-β-CD was 1∶10（V∶m）,the concentration of HP-β-CD was 40%,the time and temperature for inclusion was 80min and 55℃.No obvious change was found before and after inclusion.CONCLUSION：The optimized preparation technology of A.villous oil-hydroxypropyl-β-cyclodextrin is feasible and serves as reference for the production and research.

Amomum villous；Volatile oil；Hydroxypropyl-β-cyclodextrin；Inclusion complex；Preparation technology

R284.2；R284.1

A

1001-0408（2011）03-0225-04

Δ廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2008Z1-E461）

＊碩士研究生。研究方向：天然藥物有效成分研發(fā)。電話：020-61643557。E-mail：shengtan1986@163.com

#通訊作者：副教授，碩士研究生導(dǎo)師，博士。研究方向：天然藥物有效成分研發(fā)。電話：020-61643557。E-mail：linjm1231@21cn.com

2010-09-06

2010-11-04）