張紅蓮，鄭 龍，邊艷珠，張軍芳，王建華*

1河北醫(yī)科大學藥學院，石家莊050017;2河北省人民醫(yī)院核醫(yī)學科，石家莊050051; 3河北省實驗動物重點實驗室，石家莊050017

甲氧補骨脂素對大鼠成骨細胞生物活性影響的實驗研究

張紅蓮1，鄭 龍3，邊艷珠2，張軍芳1，王建華1*

1河北醫(yī)科大學藥學院，石家莊050017;2河北省人民醫(yī)院核醫(yī)學科，石家莊050051;3河北省實驗動物重點實驗室，石家莊050017

為探討甲氧補骨脂素對體外培養(yǎng)新生大鼠顱骨成骨細胞增殖與分化作用的影響，用改良的組織塊培養(yǎng)法分離培養(yǎng)新生大鼠顱骨成骨細胞，在成骨細胞體系中以不同濃度加入甲氧補骨脂素，MTT法檢測加藥后不同時間細胞的增殖情況;用對硝基苯二鈉基質(zhì)動力學法(PNPP)測定細胞內(nèi)堿性磷酸酶的活性，用改良的Lowry法測蛋白含量;用放射免疫法測定細胞內(nèi)骨鈣素含量。結(jié)果顯示:與對照組相比，甲氧補骨脂素組在24 h和36 h時促進體外大鼠成骨細胞增殖的作用更明顯;在24、48 h和72 h時均能提高成骨細胞堿性磷酸酶活性(ALP)和骨鈣素(BGP)的分泌。甲氧補骨脂素對體外培養(yǎng)的大鼠成骨細胞的增殖與分化均有明顯的促進作用。

成骨細胞;細胞增殖;細胞分化;骨鈣素;甲氧補骨脂素

補骨脂性溫，味辛微苦，歸腎、脾經(jīng)，具溫補腎陽之功效。含補骨脂素(psoralen)、異補骨脂素(isopsoralen)、甲氧補骨脂素(methoxypsoralen)等呋喃香豆素類化合物。香豆素類化合物為植物雌激素之一。有研究表明甲氧補骨脂素聯(lián)合長波紫外線(UVA)有促進大鼠成骨細胞增殖及堿性磷酸酶活性的作用［1］。前文［2］報道了補骨脂素對大鼠成骨細胞增殖和堿性磷酸酶活性有明顯促進作用，本文繼續(xù)探討甲氧補骨脂素對大鼠成骨細胞增殖與分化的影響，對進一步研究補骨脂香豆素類植物雌激素防治骨質(zhì)疏松的作用及中藥新藥開發(fā)有一定的意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

出生24 h內(nèi)SD系乳大鼠:性別體重不限。河北省實驗動物中心提供，動物合格證號:810010。

1.2 試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基(GIBCO);胎牛血清(北京燕生生物技術(shù)有限公司);Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶、噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)(Sigma公司);堿性磷酸酶試劑盒(保定長城試劑有限公司，批號: 20090422);甲氧補骨脂素(8-Methoxypsoralen)(上海融禾生物制品有限公司，含量 98%，批號: 080707);骨鈣素放免試劑盒(天津協(xié)和醫(yī)藥科技有限公司，批號:200907);XDS-1B型倒置相差顯微鏡(OLYMPUS);二氧化碳培養(yǎng)箱(美國NATURE公司);TECAN酶標儀(奧地利);XH-6020型γ-放射免疫計數(shù)器(國營西安二六二廠)。

1.3 新生大鼠顱骨成骨細胞的培養(yǎng)及鑒定

無菌條件下，取出生后24 h以內(nèi)的大鼠乳鼠顱蓋骨，用平衡鹽溶液PBS沖洗數(shù)次，放入0.25%的胰蛋白酶溶液中，剔除骨表面被膜及軟組織，將骨片剪成1～3 mm3的骨粒，棄去胰蛋白酶溶液。在0.1%膠原酶Ⅱ中室溫消化45 min，將消化液棄去，平衡鹽溶液PBS洗三遍。將骨粒分散于100 mL培養(yǎng)瓶中，加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5 d后，將骨粒棄去，細胞進行傳代培養(yǎng)，將細胞用胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基吹打傳代，置于細胞培養(yǎng)瓶中放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

細胞傳至第5代，通過細胞形態(tài)學觀察及堿性磷酸酶細胞化學染色鑒定所用細胞為成骨細胞［3］。細胞純度超過90%以上。

1.4 MTT法測細胞生長曲線

取傳至第5代培養(yǎng)的細胞，用0.25%的胰酶消化，制成1×104個/ml的DMEM細胞懸液，然后在96孔板的各孔內(nèi)準確接種相同數(shù)量的細胞。分別在培養(yǎng)1，2，3，4，5，6 d后，每天取8個孔，每孔加入MTT 20 μL，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，吸棄培養(yǎng)基后加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，10 min后用酶標儀測定492 nm吸光度。最后用Microsoft Excel XP軟件繪制細胞生長曲線。

1.5 成骨細胞增殖實驗的測定

將成骨細胞按2×104/mL密度接種于96孔板，待細胞70%融合后，換加含不同濃度的甲氧補骨脂素(10-9～10-5mol/L)的無血清培養(yǎng)基，分別在培養(yǎng)12 h，24 h，36 h后，每孔加入MTT 20 μL，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，吸棄培養(yǎng)基后加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，10 min后用酶標儀測定492 nm吸光度。

1.6 成骨細胞分化實驗的測定

將成骨細胞按2×104/mL密度接種于24孔板，待細胞70%融合后，換加含不同濃度的甲氧補骨脂素(10-9～10-5mol/L)的無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24，48，72 h后，分別將兩塊24孔板取出，吸取培養(yǎng)基用于骨鈣素測定。細胞用PBS沖洗3次后，每孔加入250 μL 0.1%TritonX100溶液，吹打細胞，10 min后，收集每孔的溶液，用于堿性磷酸酶及蛋白質(zhì)的測定。堿性磷酸酶(ALP)測定采用對硝基苯磷酸二鈉基質(zhì)動力學法，并用Lowry法進行蛋白質(zhì)含量測定，結(jié)果用蛋白含量校正，以每克蛋白中堿性磷酸酶國際單位(U/mg protein)表示。骨鈣素測定采用放射免疫法(RIA)，按試劑盒說明進行，以ng/mL表示。

1.7 統(tǒng)計學分析方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析，實驗結(jié)果以均數(shù)加減標準差(±s)表示。組間差異比較用單因素方差分析(ANOVA)。

2 結(jié)果

2.1 MTT法繪制生長曲線

接種后的第1 d開始，倒置顯微鏡下觀察，細胞數(shù)量擴增較慢，為細胞生長適應(yīng)期，以后細胞增長加速，第5 d達到高峰，以后增長速度逐漸減慢，見圖1。

2.2 甲氧補骨脂素對成骨細胞增殖的影響

大鼠成骨細胞在含不同濃度甲氧補骨脂素(10-9～10-5mol/L)培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，濃度為10-6mol/L和10-5mol/L與空白組比較有促增殖作用(P＜0.05);培養(yǎng)24 h，與空白組比較，各個濃度均有促增殖作用，其中10-5mol/L，10-8mol/L，10-9mol/L作用較為明顯(P＜0.01);培養(yǎng)36 h，各個濃度與空白組比較均有顯著的促增殖作用(P＜0.01)，見表1。

2.3 甲氧補骨脂素對成骨細胞分化的影響

2.3.1 對堿性磷酸酶活性的影響

堿性磷酸酶是成骨細胞分化的早期標志［4］。大鼠成骨細胞在含不同濃度甲氧補骨脂素(10-9～10-5mol/L)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，與空白組比較，濃度為10-7、10-8和10-9mol/L的甲氧補骨脂素可以提高成骨細胞堿性磷酸酶的活性，促進成骨細胞的分化。培養(yǎng)48 h，濃度為10-7、10-8、10-9mol/L促進堿性磷酸酶活性的作用，其中10-9mol/L作用較為顯著(P＜0.01)。培養(yǎng)72 h，與空白組比較，濃度為10-7、10-8、10-9mol/L有促進堿性磷酸酶活性的作用(P＜ 0.05)，見表2。

2.3.2 對骨鈣素水平的影響

骨鈣素是成骨細胞分化的晚期標志［3］。大鼠成骨細胞在不同濃度的甲氧補骨脂素存在下培養(yǎng)24 h，1×10-7、1×10-8mol/L和1×10-9mol/L可提高大鼠成骨細胞骨鈣素的表達水平，培養(yǎng)48 h后，1× 10-8mol/L繼續(xù)保持高表達水平，提高成骨細胞骨鈣素的表達;培養(yǎng)72 h后，僅1×10-9mol/L促進大鼠成骨細胞骨鈣素的分泌，見表3。

圖1 MTT法測大鼠成骨細胞生長曲線Fig.1 Growth curve of rat osteoblast cells by MTT

表1 甲氧補骨脂素對大鼠成骨細胞增殖的影響(吸光度A，n=10，±s)Table 1 Effect of 8-methoxypsoralen on the proliferation of osteoblast(A，n=10，±s)

表1 甲氧補骨脂素對大鼠成骨細胞增殖的影響(吸光度A，n=10，±s)Table 1 Effect of 8-methoxypsoralen on the proliferation of osteoblast(A，n=10，±s)

注:不同濃度甲氧補骨脂素組與空白對照組相比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01，下同。Note:Group of 8-methoxypsoralen with different concentrations compared with blank.*P＜0.05，＊＊P＜0.01.The same as follow.

濃度Concentration (mol/L)甲氧補骨脂素8-methoxypsoralen培養(yǎng)時間Period of incubation(h) 12 24 36 0 0.315±0.046 0.276±0.019 0.231±0.024 1×10-5 0.348±0.024* 0.319±0.023＊＊ 0.321±0.026＊＊1×10-6 0.352±0.033* 0.296±0.017* 0.283±0.018＊＊1×10-7 0.324±0.031 0.297±0.019* 0.273±0.026＊＊1×10-8 0.316±0.043 0.310±0.026＊＊ 0.313±0.033＊＊1×10-9 0.323±0.034 0.313±0.017＊＊ 0.325±0.023＊＊

表2 甲氧補骨脂素對大鼠成骨細胞堿性磷酸酶活性的影響(U/mg，n=8，±s)Table 2 Effect of 8-methoxypsoralen on the ALP activity of osteoblast(U/mg，n=8，±s)

表2 甲氧補骨脂素對大鼠成骨細胞堿性磷酸酶活性的影響(U/mg，n=8，±s)Table 2 Effect of 8-methoxypsoralen on the ALP activity of osteoblast(U/mg，n=8，±s)

濃度Concentration (mol/L)甲氧補骨脂素8-methoxypsoralen培養(yǎng)時間Period of incubation(h) 24 48 72 0 0.709±0.144 1.197±0.366 1.788±0.186 1×10-5 0.837±0.207 1.576±0.457 1.730±0.277 1×10-6 0.823±0.082 1.370±0.396 1.599±0.293 1×10-7 0.923±0.082* 1.805±0.779* 2.226±0.358* 1×10-8 1.379±0.155＊＊1.849±0.453* 2.242±0.369* 1×10-9 1.332±0.252＊＊2.200±0.340＊＊2.258±0.712 *

表3 甲氧補骨脂素對大鼠成骨細胞分泌骨鈣素的影響(ng/mL，n=8，±s)Table 3 Effect of 8-Methoxypsoralen on the osteocalcin secretion of osteoblast(ng/mL，n=8，±s)

表3 甲氧補骨脂素對大鼠成骨細胞分泌骨鈣素的影響(ng/mL，n=8，±s)Table 3 Effect of 8-Methoxypsoralen on the osteocalcin secretion of osteoblast(ng/mL，n=8，±s)

濃度Concentration (mol/L)甲氧補骨脂素8-methoxypsoralen培養(yǎng)時間Period of incubation(h) 24 48 72 0 0.162±0.075 1.222±0.293 1.084±0.532 1×10-5 0.621±0.390 1.430±0.429 1.024±0.337 1×10-6 0.385±0.142 1.260±0.420 1.397±0.417 1×10-7 0.868±0.457* 1.215±0.330 1.416±0.268 1×10-8 1.338±0.941＊＊1.851±0.394* 1.466±0.361 1×10-9 1.541±0.227＊＊1.478±0.254 2.065±0.684*

3 討論

成骨細胞是參與骨代謝的重要細胞，對骨組織的生長發(fā)育、損傷修復、骨代謝平衡和骨量維持起關(guān)鍵作用，它與破骨細胞共同維持著骨代謝的平衡。成骨細胞的主要功能為合成分泌堿性磷酸酶和合成骨鈣素等非膠原蛋白，并誘導基質(zhì)礦化，直接參與骨形成。一旦成骨細胞衰老，其生成不足和功能降低，將直接導致骨形成減少，引起骨質(zhì)疏松的發(fā)生。

補骨脂為豆科植物補骨脂 Psoralea corylifolia L.的成熟果實，具有溫補腎陽之功效。中醫(yī)認為，腎主骨生髓。研究表明，許多補腎中藥具有防治骨質(zhì)疏松的作用［6］。有實驗顯示用含不同濃度補骨脂注射液的DMEM培養(yǎng)成骨細胞，發(fā)現(xiàn)補骨脂對新生大鼠成骨細胞的增殖有顯著促進作用［7］。本實驗探討了甲氧補骨脂素對大鼠成骨細胞增殖分化的影響，結(jié)果顯示，甲氧補骨脂素具有促進大鼠成骨細胞增殖分化的作用。甲氧補骨脂素組在24 h和36 h時促進體外大鼠成骨細胞增殖的作用更明顯;在24 h、48 h和72 h時均能促進成骨細胞堿性磷酸酶活性(ALP)和骨鈣素(BGP)的分泌。甲氧補骨脂素對成骨細胞除刺激增殖外，對ALP活性和骨鈣素的分泌均有較好刺激作用，說明甲氧補骨脂素在促進細胞增殖的同時，也能促進細胞進一步分化成熟。因而可提高成骨細胞骨形成的功能，為骨質(zhì)疏松癥防治提供了一條途徑。

本實驗結(jié)果是甲氧補骨脂素對體外培養(yǎng)成骨細胞的直接作用，其作用機理尚待深入探討。此外，人體是一個復雜的環(huán)境，骨代謝受多種激素和因子的影響，甲氧補骨脂素對整體防治骨質(zhì)疏松的作用有待于骨質(zhì)疏松動物模型的影響實驗來進一步驗證。

1 Mainlin GI，Hornicek FJ，Banovac K，et al.Interaction of cultured rat osteoblasts with 8-methoxypsoralen during irradiation with long-wave ultraviolet light.Biochem Biophys Res Commun，1995，207;877-881.

2Wang JH(王建華)，Wang Y(王艷)，Pan YM(潘永梅).Effects of psoralen on proliferation and differentiation of cultured osteoblasts in vitro.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2007，19;844-846.

3 Situ ZQ(司徒鎮(zhèn)強)，Wu JZ(吳軍正).Cell Culture(細胞培養(yǎng)).Xi'an:World Book Publishing Company，2004.160-164.

4Jin WF(金慰芳)，Zhu WG(朱文管)，Wang HF(王洪復)，et al.Effects of HU-ECS on proliferation，differentiation and mineralization of cultured osteoblasts in vitro.Chin J Osteop (中國骨質(zhì)疏松志)，2001，7:9-11.

5 Li E(李恩)，Kong DJ(孔德娟)，Yang XH(楊學輝)，et al.Effects of kidney-tonifying chinese medicinal herbs on prevention of rat osteoporosis.Chin J Osteoporos(中國骨質(zhì)疏松志)，2002，8:166-170.

6 Lin JZ(林舉擇)，Chen SK(陳升愷)，Luo JD(羅家棟).The proliferatinve effect of psoralea injection on in-vitro-cultivated rat osteoblasts.J Tradit Chin Orthop Traumatol(中醫(yī)正骨)，2004，6:326-328.

Effects of 8-Methoxypsoralen on Proliferation and Differentiation of Cultured Osteoblasts in vitro

ZHANG Hong-lian1，ZHENG Long3，BIAN Yan-zhu2，ZHANG Jun-fang1，WANG Jian-hua1*1Faculty of Pharmacy，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China;2Isatopic Laboratory，Hebei Provincial People's Hospital，Shijiazhuang 050051，China;3Hebei Key Lab of Laboratory Animal Science，Shijiazhuang 050017，China

To study the effects of 8-methoxypsoralen on proliferation and differentiation of cultured osteoblasts in vitro，MTT，PNPP and RIA were used separately to observe the proliferation，the activity of ALP and the content of osteocalcin of osteoblasts cultured in vitro with 8-methoxypsoralen of different concentration in it for different incubation periods.Protein was measured by Lowry.The effects of promoting proliferation of rat osteoblasts cells in vitro after 24 h and 36 h were more marked by the groups of 8-methoxypsoralen compared with the control group.The activity of alkaline phosphate(ALP)and secretion of osteocalcin(BGP)were stimulated by 8-methoxypsoralen after 24，48 h and 72 h incubation.It was demonstrated that 8-methoxypsoralen has the effects on stimulating the proliferation and differentiation of cultured osteoblasts in vitro.

osteoblast;proliferation;differentiation;osteocalcin;8-methoxypsoralen

1001-6880(2011)05-0927-04

2009-08-11 接受日期:2010-04-27

河北省自然科學基金資助項目(C2009001072)，河北省科學技術(shù)研究與發(fā)展計劃項目(河北省科技支撐計劃項目 09276418D-14)，河北省中醫(yī)藥管理局課題(2007116)

*通訊作者 E-mail:smith_wang2000@126.com

R285.5

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