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HPLC法測定補(bǔ)腎益腦片中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量

王亞輝李洪澤韓風(fēng)雨

內(nèi)蒙古自治區(qū)天奇中蒙制藥股份有限公司，內(nèi)蒙古 赤峰 024000

目的建立補(bǔ)腎益腦片含量測定方法。方法用HPLC法以Dikma C18(4.6×250mm，5μm)；流動相：甲醇-水(45∶55)；檢測波長：245nm；柱溫：室溫；流速：1.0ml/min測定補(bǔ)腎益腦片中補(bǔ)腎脂數(shù)和異補(bǔ)腎脂數(shù)的含量。結(jié)果補(bǔ)骨脂素的含量在0.0744～0.4644μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9997)，異補(bǔ)骨脂素的含量在0.075～0.450μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9999)。補(bǔ)骨脂素平均回收率為99.668%，RSD%=0.94%；異補(bǔ)骨脂素平均回收率為99.5%，RSD%=1.85%。結(jié)論該含量測定方法簡便、準(zhǔn)確。

補(bǔ)腎益腦片；高效液相色譜法；補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素；含量測定

補(bǔ)腎益腦片方由鹿茸(去毛)、紅參、補(bǔ)骨脂(鹽制)等十六味藥組成。其功能主治為補(bǔ)腎益氣，養(yǎng)血生精。用于氣血兩虛，腎虛精虧，心悸氣短，失眠健忘，遺精盜汗，腰腿酸軟，耳鳴耳聾。依據(jù)《中國藥典》(2010版)中補(bǔ)腎益腦片標(biāo)準(zhǔn)[1]，經(jīng)多次試驗(yàn)，確立了本品中補(bǔ)骨脂有效成分補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素的含量測定方法，陰性無干擾，經(jīng)方法學(xué)考察，方法的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、精密度、回收率試驗(yàn)均符合有關(guān)規(guī)定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Lab Alliance高效液相色譜儀，Model 500檢測器，Series III泵，ANASTAR色譜工作站，Dikma C18柱(4.6×250mm，5μm)；AB135-S電子分析天平；Model C3860A 超聲波儀(上海超聲儀器廠)。

1.2 試藥 補(bǔ)骨脂素對照品(批號：110739-201115，中國食品藥品檢定研究院)；異補(bǔ)骨脂素(批號：110738-201012，中國食品藥品檢定研究院)；補(bǔ)腎益腦片(自制，批號20130217、20131007、20131008、20131009)。甲醇為色譜純；水為二次蒸餾水，其試劑均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 波長選擇 稱取補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素對照品適量，加甲醇溶液配成每1ml含0.06mg的溶液，在200～500nm的波長范圍內(nèi)掃描，在245nm處有最大吸收。

2.2 色譜條件 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠柱(4.6×250mm，5μm)；流動相：甲醇-水(45∶55)；檢測波長：245nm；柱溫：室溫；流速：1.0ml/min。在此條件下，補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素與其他組分均達(dá)到基線分離，理論板數(shù)按補(bǔ)骨脂素計(jì)算大于3000。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液的制備 分別取補(bǔ)骨脂素異補(bǔ)骨脂素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml各含25μg的混合溶液，即得。

2.3.2 供試品溶液的制備 取本品適量，研細(xì)，取約3.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，稱定重量，超聲處理(功率280W，頻率40kHz)30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足損失的重量，搖勻，濾過，即得。

2.3.3 陰性溶液的制備 取除補(bǔ)骨脂外其它藥材按供試品制備方法制成陰性樣品溶液。

2.4 陰性干擾試驗(yàn) 精密吸取上述三種溶液各10μl，注入液相色譜儀中，繪制液相色譜圖，在對照品色譜相應(yīng)的位置，供試品溶液具有相同保留時(shí)間的色譜峰，陰性液在此峰位無吸收，表明該方法專屬性良好。

2.5 線性范圍考察 分別精密吸取補(bǔ)骨脂素對照品溶液7.74、15.48、23.22、30.96、38.7、46.44μg/ml；異補(bǔ)骨脂素對照品溶液7.5、15、22.5、30.0、37.5、45.0μg/ml，按擬定的色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素進(jìn)樣量(μg)坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程。補(bǔ)骨脂素為：Y=5020682X-387.807(r=0.99974)；異補(bǔ)骨脂素為Y=5079826X-18635.9(r=0.9999)。補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素分別在0.0744-0.4644μg和0.075-0.450μg范圍內(nèi)與峰面積程良好的線性關(guān)系。

2.6 穩(wěn)定性性試驗(yàn) 取樣品(批號20130217)，研細(xì)，取粉末3.0g，精密稱定，按正文“2.3”制備供試液，精密吸取同一供試液，分別于0、2、4、6、8、10h進(jìn)樣分析，測定色譜峰面積，RSD%為0.97%，故供試液10h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一濃度供品溶液10μl，連續(xù)進(jìn)樣5次，測定峰面積，補(bǔ)骨脂素與異補(bǔ)骨脂素RSD%分別為1.43%和1.34%。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品(批號20130217)，研細(xì)，分別取五份，精密稱定，分別按正文“2.3”方法操作，測定，補(bǔ)骨脂素含量為4.9999、0.5042、0.5038、0.5005、0.4882 mg/g，異補(bǔ)骨脂素含量為0.4526、0.4729、0.4620、0.4584、0.4558 mg/g，總含量RSD%為1.31%，表明本試驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.9 回收率考察 精密稱取本品(批號20130217，補(bǔ)骨脂素含量0.4993mg/g和異補(bǔ)骨脂素含量0.4603mg/g)五份，每份分別加補(bǔ)骨脂素對照品(0.1162mg/ml)5ml和異補(bǔ)骨脂素(0.1072mg/ml)5ml，按正文“2.3”制備供試品溶液，按上述色譜條件依法測定，結(jié)果如下：

表1 補(bǔ)骨脂素回收率試驗(yàn)測定結(jié)果

測定結(jié)果提示：本方法補(bǔ)骨脂素回收率在98.12%～100.27%之間，RSD為0.94%，符合有關(guān)規(guī)定。

表2 異補(bǔ)骨脂素回收率測定結(jié)果

測定結(jié)果提示：本方法異補(bǔ)骨脂素回收率在 97.82%～102.52%之間，RSD為1.86%，符合有關(guān)規(guī)定。

2.10 樣品含量測定 按照以上方法條件，測定三批樣品中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量，結(jié)果如下。

表3 三批樣品含量測定結(jié)果

根據(jù)《中國藥典》2010年版一部補(bǔ)骨脂項(xiàng)下補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量規(guī)定：按干燥品計(jì)，本品含補(bǔ)骨脂素(C11H6O3)和異補(bǔ)骨脂素(C11H6O3)的總量不得少于0.70%。暫定本品每片含補(bǔ)骨脂素(C11H6O3)和異補(bǔ)骨脂素(C11H6O3)的總量計(jì)，不得少于0.23mg。

3 討論

[2]，對索氏提取和超聲提取，且對超聲提取時(shí)間進(jìn)行考察。結(jié)果表明超聲提取在30min提取已完全且與索氏提取含量相當(dāng)，由于超聲提取方便，故選擇超聲提取30min。

測定結(jié)果表明，選用補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素作為定量檢測指標(biāo)以及建立的HPLC色譜條件，方法靈敏度高，專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好并通過對三批樣品含量及藥材含量進(jìn)行考察，可作為補(bǔ)腎益腦片質(zhì)量控制指標(biāo)之一。

參考文獻(xiàn)

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[2]張衛(wèi)紅,鄭玉光,李曉松,等.HPLC法測不同產(chǎn)地補(bǔ)骨脂中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量[J].河北中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2008,23(1)：43.

R284.1

A

1007-8517(2014)17-0019-02

2014.07.09)