黃菊陽(yáng)，王 琴，畢亞男，史 紅，王躍飛，周 昆

(天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津市中藥藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193)

補(bǔ)骨脂為豆科植物補(bǔ)骨脂(PsoraleacorylifoliaL．)的干燥成熟果實(shí)，具有溫腎助陽(yáng)、納氣和止瀉的功效。補(bǔ)骨脂含有多種活性成分，主要成分為補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素。補(bǔ)骨脂的應(yīng)用十分廣泛，常用中成藥中含有補(bǔ)骨脂的有30余種。近年來(lái)，補(bǔ)骨脂的肝臟毒性引起了廣泛關(guān)注，相繼有臨床和實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道，其能導(dǎo)致肝臟毒性[1-2]，韓國(guó)曾報(bào)道了與大量食用補(bǔ)骨脂有關(guān)的急性肝炎病例。另外，部分含有補(bǔ)骨脂的中成藥，如壯骨關(guān)節(jié)丸、白蝕丸也偶見(jiàn)肝毒性報(bào)道[3-4]。補(bǔ)骨脂素與異補(bǔ)骨脂素在補(bǔ)骨脂所導(dǎo)致的肝損害中貢獻(xiàn)較大[5-6]，研究表明，異補(bǔ)骨脂素能導(dǎo)致HepG2細(xì)胞膽汁酸蓄積，進(jìn)而產(chǎn)生細(xì)胞毒性；腹腔注射異補(bǔ)骨脂素可以引起C57BL/6J小鼠肝損傷[7-8]。以上研究顯示，異補(bǔ)骨脂素在細(xì)胞水平及整體動(dòng)物水平，均能引起肝損傷?；诖耍狙芯客ㄟ^(guò)對(duì)SD大鼠連續(xù)灌胃異補(bǔ)骨脂素1、3、7 d，進(jìn)一步驗(yàn)證異補(bǔ)骨脂素對(duì)肝臟的損傷作用，探討異補(bǔ)骨脂素的毒性作用規(guī)律，并且基于膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，初步探討異補(bǔ)骨脂素肝臟毒性的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠，32只，♀♂各半，體質(zhì)量170～200 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0004。

1.2藥物與試劑異補(bǔ)骨脂素購(gòu)自天津市月牙湖科技有限公司，批號(hào)201502，其純度經(jīng)HPLC檢測(cè)大于98%。黃蓍樹(shù)膠粉購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；TRIzol購(gòu)自塞默飛世爾科技公司；谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine transaminase, ALT)試劑盒、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate transaminase, AST)試劑盒、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)試劑盒、總膽汁酸(total bile acid, TBA)試劑盒、總膽固醇(total cholesterol, TC)試劑盒、總甘油三脂(total triglyceride, TG)試劑盒、總膽紅素(total bilirubin, TBIL)試劑盒，均由中生北控生物科技股份有限公司生產(chǎn)；實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物，由上海生工生物工程有限公司合成；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、擴(kuò)增試劑盒，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3儀器Legend Micro17離心機(jī)(賽默飛世爾科技公司)；7020全自動(dòng)生化儀(日本Hitachi公司)；CFX96型熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；超聲破碎儀(Vibra-cell processors，美國(guó)Sonics公司)。

1.4方法

1.4.1異補(bǔ)骨脂素對(duì)大鼠的肝毒性 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，隨機(jī)分為對(duì)照組(黃蓍樹(shù)膠助溶劑組)、異補(bǔ)骨脂素60 mg·kg-1給藥1 d組、3 d組以及7 d組，每組8只，♀♂各半。異補(bǔ)骨脂素用受試藥5%量的黃蓍樹(shù)膠助溶，溶解于生理鹽水中。給藥結(jié)束后，所有動(dòng)物進(jìn)行麻醉取血、取肝臟，全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清中ALT、AST、ALP、TBA、TC、TG及TBIL的含量，計(jì)算肝臟系數(shù)。肝臟系數(shù)= 肝臟重量(g)/ 體質(zhì)量(g)×100%。

1.4.2實(shí)時(shí)定量PCR 稱取50～70 mg相同位置的肝臟組織，使用眼科剪將組織剪成約1 mm3大小的碎塊，加入TRIzol試劑，運(yùn)用超聲破碎儀破碎組織后，按照常規(guī)方法提取總RNA。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中cDNA樣本2 μL，上、下游引物各0.4 μL，Top/Tip Green qPCR SuperMix試劑10 μL，無(wú)RNA酶水7.2 μL。在94 ℃預(yù)變性4 min，每個(gè)循環(huán)94 ℃變性5 s，50～60 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，共35～40個(gè)循環(huán)。取2-△△CT值進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。引物序列見(jiàn)Tab 1。

2 結(jié)果

2.1異補(bǔ)骨脂素對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響如Fig 1所示，給藥前，各組動(dòng)物體質(zhì)量沒(méi)有明顯區(qū)別。給藥后，與對(duì)照組相比較，異補(bǔ)骨脂素60 mg·kg-1給藥3 d組的大鼠體質(zhì)量明顯下降。異補(bǔ)骨脂素60 mg·kg-1給藥1 d后，大鼠肝臟重量沒(méi)有明顯變化，給藥3 d和7 d后，大鼠肝臟重量明顯增加。異補(bǔ)骨脂素給藥1、3、7 d后，肝臟系數(shù)均明顯升高。

2.2異補(bǔ)骨脂素對(duì)大鼠肝臟功能的影響如Tab 2所示，大鼠給予異補(bǔ)骨脂素3 d和7 d后，血清中的ALT均明顯升高。給予異補(bǔ)骨脂素1、3、7 d后，血清中AST的含量明顯增加，ALP的水平在3組中均沒(méi)有明顯變化。TBA在異補(bǔ)骨脂素給藥7 d組的大鼠血清中明顯升高，給藥1 d和3 d組中的TC明顯降低。各給藥組中的TG均明顯上升，給藥7 d組的TBIL明顯增加。

Tab 1 Primer sequence of real-time PCR

Fig 1 Effect of isopsoralen on body weight(A), liver weight(B) and liver/body weight ratio(C)after oral administration for 1, 3 or 7

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

Tab 2 Effect of isopsoralen on levels of ALT, AST, ALP, TBA, TC, TG and TBIL in rat serumafter oral administration for 1, 3 or 7

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

Fig 2 The mRNA levels of BSEP, NTCP, MRP2, MRP4, MDR1, ABCG5, ABCG8 and OSTαin rat liver after oral administration for 1, 3 or 7

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

2.3異補(bǔ)骨脂素對(duì)肝臟主要膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的影響如Fig 2所示，大鼠給予異補(bǔ)骨脂素3 d和7 d后，肝臟中膽鹽輸出泵(bile salt export pump, BSEP)的mRNA水平明顯下降，異補(bǔ)骨脂素1、3、7 d組中鈉離子-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)蛋白(sodium taurocholate cotransporting polypeptide, NTCP)的mRNA水平明顯下降，BSEP、NTCP的mRNA之比也明顯升高。異補(bǔ)骨脂素給藥1 d和7 d后，多藥耐藥相關(guān)蛋白2(multidrug resistance associated protein 2, MRP2)的mRNA水平明顯下降，異補(bǔ)骨脂素給藥3 d組中MRP2的mRNA水平有下降趨勢(shì)，但是差異無(wú)顯著性。各組中多藥耐藥相關(guān)蛋白4(multidrug resistance associated protein 4, MRP4)的mRNA水平均沒(méi)有明顯變化。異補(bǔ)骨脂素給藥3 d和7 d組中，多藥耐藥蛋白1(multidrug resistance 1, MDR1)的mRNA水平明顯下降。異補(bǔ)骨脂素給藥1、3、7 d后，三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G超家族成員5(ATP-binding cassette subfamily G member 5, ABCG5)、ABCG8、有機(jī)溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白α(organic solute transporter alpha, OSTα)的mRNA水平均明顯下降。

3 討論

補(bǔ)骨脂應(yīng)用十分廣泛，歷代中醫(yī)用于治療腎虛、冷瀉、遺滑精、小便頻數(shù)、腰膝冷痛等，外治用于皮膚病、白癜風(fēng)等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，補(bǔ)骨脂具有擴(kuò)張冠脈、抗腫瘤、抗菌、抗抑郁、擬雌激素樣等多種作用[9-12]。然而，補(bǔ)骨脂的肝毒性也被多個(gè)研究報(bào)道證實(shí)，且其毒性成分和致毒機(jī)制尚不清楚。異補(bǔ)骨脂素為補(bǔ)骨脂的主要活性成分，其可能與補(bǔ)骨脂引起的肝損害和膽汁淤積有關(guān)。

肝細(xì)胞壞死時(shí)，由于肝細(xì)胞膜破損，細(xì)胞內(nèi)的一些酶溢出細(xì)胞外，如ALT、AST 等。因此，胞外或血清中ALT和AST的含量能敏感地反映肝細(xì)胞損傷與否及損傷程度。在本實(shí)驗(yàn)中，給予異補(bǔ)骨脂素后，血清中ALT和AST的水平持續(xù)明顯升高，尤其是AST，在給予異補(bǔ)骨脂素1 d之后即有明顯的上升，提示異補(bǔ)骨脂素給藥1～7 d均能引起肝損傷。異補(bǔ)骨脂素給藥1 d和3 d后，TC的含量明顯降低；異補(bǔ)骨脂素給藥7 d后，TBA明顯增加。由于膽固醇是合成膽汁酸的原料，該結(jié)果說(shuō)明異補(bǔ)骨脂素作用后，可能引起了由膽固醇合成膽汁酸增多，從而造成TC含量的下降和TBA含量的升高。異補(bǔ)骨脂素給藥1、3、7 d后，TG的含量均明顯升高，表明異補(bǔ)骨脂素作用后引起肝功能的減退，可能加重機(jī)體的脂肪負(fù)荷。異補(bǔ)骨脂素給藥7 d后，TBIL的水平也明顯升高，表明異補(bǔ)骨脂素作用7 d，造成肝細(xì)胞的受損和肝功能的減退。另外，異補(bǔ)骨脂素作用1 d之后引起肝系數(shù)的明顯升高，并且一直保持高水平。以上研究表明，異補(bǔ)骨脂素作用1 d即引起肝臟的損傷，表現(xiàn)出急性肝臟毒性；作用3 d后，肝臟的損傷進(jìn)一步加重；作用7 d，肝臟的損傷持續(xù)存在，但是沒(méi)有進(jìn)一步加重的趨勢(shì)。而引起肝臟損傷的因素有多種，在本研究中，異補(bǔ)骨脂素的作用能導(dǎo)致膽汁酸水平的升高，最終造成膽汁淤積，損傷肝臟，但是其確切機(jī)制還需進(jìn)一步探討。

研究表明，造成膽汁淤積和肝損傷的原因除與膽汁形成有關(guān)以外，還與膽汁酸的分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程紊亂有關(guān)[13]。膽汁酸在肝臟中合成，通過(guò)各級(jí)管道最終分泌到十二指腸，進(jìn)行輔助消化脂肪。而膽汁酸在細(xì)胞內(nèi)濃度過(guò)高，可導(dǎo)致線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而引起毒性的產(chǎn)生[14]。BSEP 和NTCP是肝細(xì)胞膜上兩個(gè)重要的膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，BSEP 將膽汁酸由肝細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞間膽管，NTCP則將膽汁酸從血液轉(zhuǎn)運(yùn)至肝細(xì)胞。這兩種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的正常生理功能對(duì)于維持血液和肝細(xì)胞中的膽汁酸平衡至關(guān)重要。在本研究中，異補(bǔ)骨脂素可以抑制BSEP mRNA的水平，且隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用越明顯，具有一定的時(shí)間依賴性。同時(shí)，異補(bǔ)骨脂素也能降低NTCP mRNA水平，并且該抑制作用呈現(xiàn)時(shí)間依賴性地減弱。該數(shù)據(jù)表明，異補(bǔ)骨脂素給藥后，引起B(yǎng)SEP 和NTCP轉(zhuǎn)錄水平的改變，可能對(duì)膽汁酸的轉(zhuǎn)運(yùn)造成影響。而NTCP mRNA水平的降低可能與肝細(xì)胞內(nèi)膽汁淤積后，負(fù)反饋調(diào)節(jié)NTCP 的轉(zhuǎn)錄，抑制其不斷向肝細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸膽汁酸有關(guān)，這也與之前的文獻(xiàn)報(bào)道一致[15]。MRP2、MDR1、ABCG5及ABCG8與BSEP類似，位于肝細(xì)胞的頂側(cè)，主要功能是把肝細(xì)胞中的膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)到微膽管，從而排出肝細(xì)胞中過(guò)量的膽汁酸。異補(bǔ)骨脂素作用1、3、7 d能抑制MRP2、MDR1、ABCG5、ABCG8的mRNA水平，推測(cè)其可能抑制膽汁酸從肝細(xì)胞排向膽管。MRP4和OSTα主要功能是把肝細(xì)胞中的膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)到血液中。異補(bǔ)骨脂素對(duì)MRP4 mRNA的水平?jīng)]有影響，但是能夠明顯抑制OSTα mRNA的水平，從而抑制膽汁酸向血液排出。以上研究表明，異補(bǔ)骨脂素給藥1、3、7 d能干擾膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的轉(zhuǎn)錄，從而抑制膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能，造成肝臟損傷。而膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的水平主要受核受體的調(diào)控，法尼醇X受體(farnesoid X receptor, FXR)、孕烷X受體(pregnane X receptor, PXR)等核受體，通過(guò)調(diào)控膽汁酸的代謝、外排與轉(zhuǎn)運(yùn)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)膽汁酸穩(wěn)態(tài)的調(diào)控[16]。因此，異補(bǔ)骨脂素是否通過(guò)核受體調(diào)控膽汁酸水平，導(dǎo)致肝損傷，將是我們下一步研究要解決的主要問(wèn)題。

綜上所述，異補(bǔ)骨脂素給藥可造成肝臟的損傷，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，從而導(dǎo)致肝損傷。