劉 丹，潘連紅，金良友，雷登徐，易 均，張永慧

( 1. 重慶三峽醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部藥理學(xué)教研室；2. 重慶市抗腫瘤天然藥物工程技術(shù)研究中心；3. 重慶三峽學(xué)院外國(guó)語(yǔ)學(xué)院英語(yǔ)系專(zhuān)業(yè)英語(yǔ)教研室，重慶 404120)

溶栓治療、冠狀動(dòng)脈介入和冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)能使缺血的心肌恢復(fù)血液灌注，縮小心肌梗死面積，降低死亡率。然而，再灌注后出現(xiàn)的心律失常、心肌頓抑、無(wú)復(fù)流現(xiàn)象、心功能不全，也在威脅著患者的生命。因此，開(kāi)發(fā)安全有效的抗心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia/reperfusion injury，MI/RI)藥物，改善冠心病患者預(yù)后，仍是需要迫切解決的重要問(wèn)題。

柚皮苷(naringin，Nar)是一種存在于葡萄柚、橘、橙的果皮和果肉中的二氫黃酮類(lèi)化合物。有研究表明，柚皮苷通過(guò)抑制炎癥、氧化應(yīng)激和NF-κB在體內(nèi)外的激活，減輕糖尿病視網(wǎng)膜病變[1]。柚皮苷通過(guò)調(diào)節(jié)一氧化氮水平，對(duì)大鼠內(nèi)臟缺血/再灌注損傷產(chǎn)生保護(hù)作用[2]。富含柚皮苷的川芎皮對(duì)小鼠全腦缺血/再灌注損傷有保護(hù)作用[3]。柚皮苷抑制糖尿病心肌病氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[4]。然而，柚皮苷在MI/RI中的心臟保護(hù)機(jī)制，尤其是與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)相關(guān)的信號(hào)通路，尚不十分清楚。本研究擬建立H9c2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)損傷模型，通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Western blot檢測(cè)CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein-homologous protein，CHOP)、活化轉(zhuǎn)錄因子4(activating transcription factor 4，ATF4)、真核翻譯起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α)、p-eIF2α、雙鏈RNA樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(double-stranded RNA like endoplasmic reticulum kinase，PERK)、p-PERK蛋白表達(dá)變化，探討Nar對(duì)H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑的影響及其分子作用機(jī)制。

1 材料

1.1細(xì)胞株與分組H9c2心肌細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)80%～90%融合后，將H9c2心肌細(xì)胞隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組(C)、H/R組、Nar 10 mg·L-1組(L)、Nar 20 mg·L-1組(M)、Nar 40 mg·L-1組(H)。

1.2藥物與試劑Nar購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：15015502，純度≥95%。MTT試劑盒(Sigma公司，批號(hào)：146500700)；DMEM培養(yǎng)基(批號(hào)：12800017)、胎牛血清(批號(hào)：10099133)，均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胰蛋白酶(碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)：C0201)；TUNEL試劑盒(瑞士Roche公司，批號(hào)：REF 11684817910)；PERK抗體(批號(hào)：ab79483)、p-eIF2α抗體(批號(hào)：ab32157)、ATF4抗體(批號(hào)：ab23760)、CHOP抗體(批號(hào)：ab11419)，均購(gòu)自Abcam公司；p-PERK抗體(Cell Signaling Technology公司，批號(hào)：3179S)；eIF2α抗體(Santa Cruz公司，批號(hào)：133132)；ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒 (Pierce公司，批號(hào)：34580)。

1.3儀器CL31R型低溫超速離心機(jī)、多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)；IX70倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；GDS8000凝膠掃描系統(tǒng)(美國(guó)UVP公司)。

2 方法

2.1H/R模型的建立參照文獻(xiàn)[5]，C組用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在通有95%空氣+5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)正常培養(yǎng)24 h；H/R組將心肌細(xì)胞置換到無(wú)糖、無(wú)血清、缺氧的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h，更換為正常培養(yǎng)基，然后恢復(fù)培養(yǎng)24 h；H/R加不同濃度Nar預(yù)處理組：分別加入柚皮苷10、20、40 mg·L-1，對(duì)心肌細(xì)胞預(yù)處理6 h，在氧氣和葡萄糖剝奪下培養(yǎng)4 h，然后恢復(fù)培養(yǎng)24 h。

2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率將H9c2細(xì)胞培養(yǎng)至密度為90%左右，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按實(shí)驗(yàn)分組接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔的細(xì)胞數(shù)為5×103個(gè)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，接種后置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h。分別在給藥組中加入終濃度為10、20、40 mg·L-1的柚皮苷，培養(yǎng)6 h后，將H/R和柚皮苷3個(gè)劑量組在無(wú)糖、無(wú)血清、缺氧的DMEM培養(yǎng)基中處理4 h，之后在正常條件下培養(yǎng)24 h。C組不作任何處理。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別處理后，加入5 g·L-1MTT溶液10 μL，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4～6 h，小心吸去上清。每孔加入150 μL DMSO以溶解細(xì)胞形成的紫色結(jié)晶，在酶標(biāo)儀上測(cè)定其在490 nm處OD值，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組OD/對(duì)照組OD×100%，重復(fù)測(cè)定3次。

2.3TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡按TUNEL原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作。細(xì)胞爬片經(jīng)多聚甲醛固定及PBS洗滌后，TUNEL法原位標(biāo)記心肌凋亡細(xì)胞核。光鏡200倍下觀察，凋亡細(xì)胞核染成棕黃色，正常細(xì)胞核染成藍(lán)色。

2.4Westernblot檢測(cè)復(fù)氧處理結(jié)束后，迅速收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS小心洗滌3遍，加入含有PMSF的細(xì)胞裂解液，置于冰上作用30 min。12 000 r·min-1離心15 min，取上清液，用BCA法測(cè)定蛋白濃度并進(jìn)行蛋白定量，經(jīng)聚丙烯酰胺變性凝膠電泳分離蛋白，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜，50 mol·L-1脫脂牛奶封閉，分別加入CHOP、ATF4、p-PERK、PERK、p-eIF2α、eIF2α抗體(1 ∶2 000)，4 ℃過(guò)夜，TBST洗3次，加對(duì)應(yīng)1 ∶5 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，TBST洗3次，使用 ECL-plus試劑盒發(fā)光，通過(guò)生化檢測(cè)系統(tǒng)成像并分析結(jié)果，以β-actin作為內(nèi)參照，檢測(cè)目的蛋白表達(dá)情況。

3 結(jié)果

3.1柚皮苷對(duì)H/R引起的心肌細(xì)胞存活率的影響Fig 1結(jié)果顯示，與C組相比，H/R組中H9c2心肌細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.05)；與H/R模型組相比，Nar預(yù)處理可以增加H/R損傷細(xì)胞的存活率，且Nar 40 mg·L-1組效果最好(P<0.05)。

Fig 1 Effect of Nar on survival rate of H9c2 cardiac myocytes exposed to simulated

*P<0.05vsgroup C;#P<0.05vsgroup H/R

3.2柚皮苷對(duì)H/R引起的心肌細(xì)胞凋亡的影響Fig 2結(jié)果顯示，與C組相比，H/R組心肌細(xì)胞TUNEL陽(yáng)性核細(xì)胞比例明顯增加(P<0.05)；與H/R模型組相比，H/R+Nar組TUNEL陽(yáng)性核細(xì)胞比率明顯降低(P<0.05)。

3.3柚皮苷對(duì)H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子表達(dá)的影響Fig 3的Western blot結(jié)果顯示，與C組相比，H/R組CHOP、ATF4、p-eIF2α/eIF2α、p-PERK/PERK表達(dá)水平升高(P<0.05)；與H/R組比較，柚皮苷3個(gè)劑量組可使CHOP、ATF4、p-eIF2α/eIF2α、p-PERK/PERK表達(dá)水平降低，以柚皮苷20、40 mg·L-1組效果明顯(P<0.05)。

Fig 2 Effect of Nar on apoptotic rate of H9c2 cardiac myocytes exposed to H/R(×200)

Fig 3 Effect of Nar on expression of CHOP, ATF4, p-eIF2α/eIF2α and p-PERK/PERK of H9c2 cardiac myocytes exposed to

*P<0.05vsgroup C;#P<0.05vsgroup H/R

4 討論

柚皮苷具有抗氧化、抗凋亡、抗炎、抗癌等藥理作用。有研究表明，柚皮苷通過(guò)抑制p38 MAPK通路，保護(hù)心肌細(xì)胞免受阿霉素誘導(dǎo)的凋亡。體內(nèi)研究表明，柚皮苷通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制卵巢腫瘤增殖[6-7]。柚皮苷能保護(hù)心肌細(xì)胞，對(duì)抗阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，降低葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)的表達(dá)及活性氧的產(chǎn)生，其保護(hù)作用可能與抗氧化應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)[8]。H9c2心肌細(xì)胞被廣泛認(rèn)為是心肌系統(tǒng)研究的細(xì)胞模型，在體外研究H/R損傷細(xì)胞方面，已經(jīng)建立了H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷模型[9]。因此，我們研究了柚皮苷在H/R中的作用及其可能的保護(hù)機(jī)制。本研究在H9c2心肌細(xì)胞H/R之前，用Nar預(yù)處理6 h，缺氧4 h復(fù)氧24 h后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，H/R處理后，H9c2心肌細(xì)胞存活率降低，凋亡明顯增加，而使用Nar后，可明顯抑制H/R誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果與柚皮苷通過(guò)Nrf2信號(hào)通路，對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用研究結(jié)果一致[9]。提示柚皮苷通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)H9c2心肌細(xì)胞免受H/R損傷。

MI/RI常見(jiàn)的機(jī)制有氧化應(yīng)激、Ca2+超載、細(xì)胞凋亡與自噬等。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是細(xì)胞凋亡三大途徑之一[10]，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在缺血心肌細(xì)胞凋亡中起著重要作用。雷帕霉素[11]、黃芪甲苷[12]等通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，發(fā)揮心肌保護(hù)作用，提示抑制ER應(yīng)激可能是一個(gè)主要的治療靶點(diǎn)。為了證實(shí)柚皮苷的保護(hù)機(jī)制是否與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的體外心肌細(xì)胞H/R損傷有關(guān)，本研究進(jìn)一步探討了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡在柚皮苷對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，柚皮苷可逆轉(zhuǎn)H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白CHOP、ATF4、p-eIF2α/eIF2α、p-PERK/PERK的表達(dá)上調(diào)，抑制了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路PERK-eIF2α-ATF4-CHOP的激活。

在MI/RI中,心肌細(xì)胞通過(guò)CHOP和caspase-12信號(hào)通路的激活，而產(chǎn)生細(xì)胞凋亡[13]。CHOP可引起B(yǎng)cl-2蛋白家族成員失衡，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體釋放，激活凋亡信號(hào)通路及相關(guān)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終心肌細(xì)胞在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)下的細(xì)胞凋亡增加[14]。根據(jù)上述結(jié)果以及柚皮苷對(duì)H/R細(xì)胞凋亡的抑制作用，我們認(rèn)為，柚皮苷通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減輕H/R誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。表明柚皮苷改善了H/R誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和凋亡，與調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，柚皮苷對(duì)H/R損傷的H9c2心肌細(xì)胞有保護(hù)作用，提示柚皮苷對(duì)H/R損傷的保護(hù)作用可能與激活PERK-eIF2α-ATF4-CHOP信號(hào)通路，進(jìn)而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)。柚皮苷抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能是一種新的心肌保護(hù)機(jī)制，可建立一種逆轉(zhuǎn)MI/RI的治療途徑。然而，本研究?jī)H限于MI/RI的體外細(xì)胞模型，還需進(jìn)一步開(kāi)展體內(nèi)或臨床研究來(lái)證明柚皮苷對(duì)MI/RI的心臟保護(hù)作用。

(致謝: 感謝重慶三峽醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校工程中心實(shí)驗(yàn)室為本課題研究提供儀器設(shè)備和技術(shù)支持。)