鐘艷梅， 陳堅平， 陳淑玲， 馮毅凡， 鐘詢龍

(1. 廣東藥科大學新藥研發(fā)中心，廣東 廣州 510006；2. 廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院藥學部，廣東 廣州 510260；3. 中山大學附屬第一醫(yī)院藥學部，廣東 廣州 510080)

核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)是一種多效轉(zhuǎn)錄因子。正常細胞中的NF-κB處于失活狀態(tài)，它主要以p50/p65二聚體形式與其抑制蛋白(inhibitor kappa B，I-κB)結合，存在于胞質(zhì)中?；钚匝?、細胞因子等多種刺激可誘導I-κB磷酸化，使其與p50/p65解離而活化NF-κB，并轉(zhuǎn)移至胞核內(nèi)，與凋亡相關基因結合促進基因轉(zhuǎn)錄，誘導細胞凋亡，造成機體損害。氧化應激是多種疾病炎性病變的重要因素，而NF-κB-誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)-NO信號通路是機體內(nèi)一條重要的氧化應激通路[1-3]，NF-κB的活化不僅使許多編碼炎癥介質(zhì)、細胞因子等的促炎癥基因表達上調(diào)，而且可以激活iNOS等相關酶類及血管細胞黏附分子，使炎癥反應級聯(lián)放大，激活炎癥介質(zhì)趨化及相關炎癥細胞。

知母為百合科植物知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge)的干燥根莖，味苦，性寒，歸肺、胃、腎經(jīng)，具有清熱瀉火、滋陰潤燥等功效，主治溫熱病、高熱煩渴、咳嗽氣喘、燥咳、便秘、骨蒸潮熱、虛煩不眠、消渴淋濁等癥，是一種常用的苦寒清熱傳統(tǒng)中藥，其主要的活性成分為知母皂苷(saponins fromAnemarrhenaasphodeloidesBge，SAaB)。研究表明，SAaB具有抗腫瘤、抗凝血、抗阿爾茨海默病、改善學習記憶、抗血栓、降脂、降糖等作用[4-5]。最新研究發(fā)現(xiàn)，SAaB還可明顯抑制肥大細胞TNF-α、IL-6合成與釋放[6]，以及抑制小鼠嗜堿性粒細胞釋放各種炎癥介質(zhì)[7]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，SAaB能夠明顯下調(diào)糖尿病大鼠血漿中TNF-α、IL-6含量[8]，推測其多種藥理作用可能與抗炎活性密切相關，但具體的抗炎機制尚不清楚，可能與Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR-4)/NF-κB、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)-細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)、JAK-STAT等信號通路有關。目前，SAaB對RAW264.7細胞功能的影響尚未見報道。本研究以脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導RAW264.7作為炎癥細胞模型，探討SAaB通過調(diào)節(jié)NF-κB-iNOS-NO信號通路對RAW264.7細胞功能的影響，進一步從細胞水平闡明其可能的抗炎機制，以期為其后續(xù)開發(fā)奠定理論基礎。

1 材料

1.1細胞RAW264.7細胞株，購自上海賽齊生物工程有限公司。

1.2藥物與試劑SAaB提取物按實驗室前期提取純化工藝制備(皂苷含量以菝葜皂苷元計52%)[9]，精確稱取32 mg SAaB，用PBS溶解，配成320 mg·L-1的母液，-20 ℃儲存?zhèn)溆?。DMEM高糖培養(yǎng)基(批號p002548，Gibco)；IL-6 ELISA檢測試劑盒(批號020680114)、TNF-α高靈敏度 ELISA檢測試劑盒(批號0282H80121)，均購自杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司；iNOS ELISA檢測試劑盒(批號CK-E20450M，艾萊薩生物科技上海有限公司)； MTT(批號A1720090，Aladdin)；RIPA細胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒(北京普利萊基因技術有限公司)；化學發(fā)光劑ECL(碧云天生物技術研究所)；NF-κB p65抗體(美國Cell Signaling公司)；β-actin抗體(批號306010，美國Santa Cruz公司)；PE標記山羊抗小鼠、FITC標記山羊抗兔二抗(美國Santa Cruz公司)。

1.3儀器倒置顯微鏡(江南顯微鏡有限公司)；酶標儀(美國Bio-Rad)；超凈工作臺(江蘇凈化設備有限公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(SL SHELLAB)；超低溫冰箱(SANYO)；高速冷凍離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng)RAW264.7細胞以完全培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當細胞融合度達到80%，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗細胞2～3次后，加入胰酶，充分接觸消化細胞，吹打收集細胞，1 ∶3傳代培養(yǎng)，隔天換液。

2.2MTT法檢測細胞增殖取對數(shù)生長期的細胞，消化后計數(shù)，調(diào)整細胞密度為3×109·L-1，接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，分別設置調(diào)零組、空白對照組、SAaB組(160、80、40、20、10、5、2.5、1.75 mg·L-1)，每組設置6個復孔，空白組和藥物組每孔加入細胞液100 μL，調(diào)零組加入完全培養(yǎng)基100 μL，接種至96孔板中，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸棄上清，每孔加入100 μL MTT試劑，放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，吸棄上清，每孔加入150 μL DMSO，置搖床10 min，酶標儀570 nm波長測量每孔的吸光度值。細胞存活率=(ODSAaB干預組-OD調(diào)零組)/(OD空白對照組-OD調(diào)零組)×100%。

2.3細胞培養(yǎng)及分組取對數(shù)生長期的細胞，消化后計數(shù)，調(diào)整細胞密度為3×108·L-1，接種96孔板，預培養(yǎng)24 h后，分別設置：①空白對照組：正常培養(yǎng)的RAW264.7細胞組；②炎癥模型組(LPS濃度為10 mg·L-1)；③LPS+SAaB組(SAaB濃度分別為30、3、0.3 mg·L-1)；④LPS+布洛芬組(100 mg·L-1)。每組設置6個復孔?？瞻捉M和炎癥模型組每孔加入100 μL完全培養(yǎng)基，其余組加入相應含藥物的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)箱培育1 h。

2.4Griess法測定RAW264.7細胞中NO含量同“2.3”項下培養(yǎng)細胞并分組，除空白組外，每孔加入100 μL LPS(10 mg·L-1)，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，每孔吸取50 μL細胞上清液至另一新的96孔板中，每孔加入50 μL A液(稱取1.0 g無水對氨基苯磺酸于燒杯中，加入6 mL 85%濃磷酸，去離子水溶解定容至100 mL)，細胞培養(yǎng)箱孵育10 min后，每孔加入50 μL B液(取0.1 g N-1-萘乙二胺鹽酸鹽于燒杯中，去離子水溶解定容至100 mL)，搖床震蕩10 min。酶標儀于546 nm處測量每孔的吸光度，后根據(jù)NaNO2標準溶液(精確稱取6.9 mg NaNO2于燒杯中，去離子水溶解定容至10 mL)吸光度繪制標準曲線，算出每孔的NO濃度。

2.5ELISA法測定RAW264.7細胞中TNF-α、IL-6、iNOS的含量同“2.3”項下培養(yǎng)細胞并分組，除空白組外，每孔加入100 μL LPS(10 mg·L-1)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，吸取細胞液上清，按ELISA試劑盒說明書，測定各組細胞TNF-α、IL-6、iNOS的含量。

2.6Westernblot法檢測RAW264.7細胞中NF-кBp65蛋白表達同“2.3”項下培養(yǎng)細胞并分組，除空白組外，每孔加入100 μL LPS(10 mg·L-1)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，提取細胞總蛋白，采用BCA蛋白定量法檢測各組細胞蛋白濃度，95 ℃滅活蛋白5 min，SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，8%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL顯色。

3 結果

3.1RAW264.7細胞形態(tài)特征各組RAW264.7細胞形態(tài)如Fig 1所示，正常RAW264.7細胞呈圓形或橢圓形，LPS刺激誘導24 h，模型組細胞形態(tài)改變明顯，體積增大，拉伸呈梭形。與模型組比較，不同濃度SAaB與LPS共刺激，發(fā)現(xiàn)大部分細胞仍為圓形，形態(tài)趨向正常細胞。

3.2SAaB對正常RAW264.7細胞活力的影響Fig 2的MTT結果顯示，SAaB在0～80 mg·L-1對正常RAW264.7細胞無毒性作用，但當濃度達到160 mg·L-1時，細胞活力下降。

3.3SAaB對LPS誘導的RAW264.7細胞中NO、TNF-α、IL-6、iNOS的影響

Fig 1 Effects of SAaB on morphology of RAW264. 7 cells (×200)

A: Control group; B: LPS group; C: LPS+Ibuprofen group; D: SAaB (0.3 mg·L-1) +LPS; E: SAaB (3 mg·L-1) +LPS; F: SAaB (30 mg·L-1) +LPS.

Fig 2 Effects of SAaB on proliferation of RAW264.7 cells

3.3.1SAaB對RAW264.7細胞中NO含量的影響 Griess法測定不同濃度SAaB干預下，LPS誘導的RAW264.7炎癥細胞中NO含量。如Fig 3所示，與對照組相比，LPS誘導的RAW264.7細胞中NO含量明顯增加(P<0.01)；與LPS炎癥模型組比較，SAaB各組中NO含量均明顯下降(P<0.01，P<0.05)，且呈現(xiàn)濃度依賴性。

3.3.2SAaB對RAW264.7細胞中TNF-α、IL-6和iNOS分泌量的影響 Tab 1的ELISA檢測結果顯示，與對照組相比，LPS誘導的RAW264.7細胞中TNF-α、IL-6和iNOS表達量明顯增加(P<0.01)；與LPS炎癥模型組比較，不同濃度SAaB干預組中TNF-α、IL-6和iNOS表達量明顯下降(P<0.01)。

Fig 3 Effects of SAaB on contents of NO in RAW264.7 cells n=6)

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsLPS group

Tab 1 Effects of SAaB on contents of TNF-α, IL-6 and iNOS in RAW264.7 cells n=6)

##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsLPS group

3.4SAaB對LPS誘導的RAW264.7細胞中NF-κBp65蛋白表達的影響Fig 4的Western blot結果顯示，LPS誘導的RAW264.7細胞中NF-κB p65蛋白的表達水平明顯增加(P<0.01)，而不同濃度SAaB干預組的表達量則明顯下降。結果提示，SAaB能夠抑制NF-κB p65蛋白的表達，抑制其轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，進而抑制炎癥因子進一步活化。

4 討論

炎癥反應是機體受到來自于內(nèi)部或外部的刺激而產(chǎn)生的防御反應，在一定程度內(nèi)起到保護機體的作用，但長期、劇烈的炎癥反應會參與多種疾病的病理進程，如2型糖尿病、動脈粥樣硬化、腫瘤、風濕性關節(jié)炎、慢性阻塞性肺疾病、感染性休克等[10-11]。炎癥是這些疾病的病理基礎，治療免疫炎癥反應，逐漸成為新藥開發(fā)的重要靶點。

近年來研究表明，SAaB作為知母主要藥理活性成分，具有明顯的抗炎活性，臨床應用前景廣闊。然而，SAaB抗炎作用，尤其是對RAW264.7炎癥細胞功能的調(diào)節(jié)機制研究并不深入。因此，本研究以RAW264.7細胞作為載體，采用LPS建立體外細胞炎癥模型，探討SAaB對LPS誘導的RAW264.7細胞功能的調(diào)控作用。

Fig 4 Effects of SAaB on expression levels of NF-κB p65 protein in RAW264.7 cells n=6)

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsLPS group

本研究結果顯示，不同濃度的SAaB與LPS共刺激24 h后，僅160 mg·L-1的SAaB抑制RAW264.7細胞增殖，而濃度在0～80 mg·L-1的SAaB對正常RAW264.7細胞生長無明顯抑制。這與160 mg·L-1的SAaB對RAW264.7細胞有細胞毒作用相關，說明實驗設置的SAaB高、中、低劑量組(30、3、0.3 mg·L-1)無明顯細胞毒性，具有研究意義。顯微鏡下觀察到LPS刺激RAW264.7細胞24 h可以改變其形態(tài)，細胞體積增大，呈梭形，而0.3～30 mg·L-1的SAaB和LPS共同作用24 h后，細胞形態(tài)變規(guī)則，并恢復成圓形。

LPS誘導激活RAW264.7細胞，使iNOS水平明顯增加，iNOS活化后會直接催化NO持續(xù)生成，導致NO釋放量明顯升高，進而使得細胞分泌釋放重要的炎癥標志因子TNF-α，而TNF-α在炎癥網(wǎng)絡中具有關鍵作用，是全身炎性反應的始動介質(zhì)，可誘導IL-1和IL-6表達釋放，使炎性損傷的級聯(lián)效應放大，從而進一步加劇炎癥反應[12-14]。NF-κB核轉(zhuǎn)錄因子作為炎癥過程中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，當細胞受到LPS刺激后，NF-κB活化二聚體會在NF-κB信號通路激活，易位進入細胞核內(nèi)，并與細胞核內(nèi)的靶基因在κB位點發(fā)生特異性結合，從而調(diào)控NO的生成和細胞因子TNF-α、IL-6等的表達和釋放[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，SAaB可抑制LPS誘導的炎癥細胞NO釋放增加，并呈濃度依賴性，提示SAaB具有抗炎活性，且不是通過抑制細胞活力來抑制NO分泌。SAaB可下調(diào)NF-κB p65蛋白表達水平，同時減少TNF-α、IL-6等炎癥因子的產(chǎn)生。此外，實驗結果也提示了LPS可引起NF-κB p65的蛋白表達水平增高，并且在LPS誘導的炎癥過程中，NF-κB-iNOS-NO三者的激活及產(chǎn)物的生成在時間上具有同步性，而使用陽性對照藥(布洛芬)和SAaB后，均可抑制上述效應，進一步揭示了SAaB可通過NF-κB-iNOS-NO信號通路，抑制LPS誘導的炎癥反應。以NF-κB-iNOS-NO信號通路為切入點，研究具有下調(diào)巨噬細胞該通路活性，并且能產(chǎn)生明顯抗炎、抗免疫作用的藥物，對于慢性免疫炎癥性疾病的治療具有廣闊的應用前景。

綜上所述，本研究結果表明SAaB可明顯抑制LPS誘導的RAW264.7細胞中炎癥因子NO、TNF-α、IL-6、iNOS的釋放，并且能下調(diào)RAW264.7細胞NF-κB p65蛋白表達水平，表明SAaB能通過下調(diào)NF-κB-iNOS-NO信號通路，抑制炎癥因子的過度表達，從而抑制炎癥反應。本文從細胞水平初步探討了SAaB抗炎的作用機制，為其臨床應用與后續(xù)開發(fā)奠定了理論基礎。

(致謝：本實驗完成于廣東藥科大學中心實驗室，感謝廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院藥學部的老師對本課題的指導，感謝課題組全體老師和同學對實驗的支持與幫助。)