田崇梅，夏道宗，邢夢(mèng)雨，郭 璐，張曉熙，趙鑫鈺

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310053)

肺癌發(fā)生于支氣管黏膜上皮，研究顯示，肺癌的死亡率位居我國(guó)惡性腫瘤死亡率的第1位[1]。硒(selenium，Se)是一種關(guān)鍵的營(yíng)養(yǎng)微量元素，在人體的發(fā)病機(jī)制與穩(wěn)態(tài)中扮演著重要角色[2]。本研究組在前期已經(jīng)證實(shí)了亞硒酸鈉(sodium selenite)體外具有螯合鉛的作用[3]，并有研究顯示亞硒酸鈉可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[4]，包括人肺腺癌A549細(xì)胞[5]、肝癌細(xì)胞[6]等，但其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚不明確。Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1 (Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)/核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2)/抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)信號(hào)通路是重要的抗氧化應(yīng)激通路，也是近十年來(lái)抗氧化研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)，對(duì)這一通路的深入研究，將能夠解釋或部分解釋機(jī)體對(duì)癌癥進(jìn)行自身防御抵抗的機(jī)制，此通路是肺癌治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)[7]。本研究以人肺腺癌A549細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)觀察細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞形態(tài)學(xué)、抗氧化指標(biāo)檢測(cè)等，研究亞硒酸鈉對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞的作用。初步探討亞硒酸鈉對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡的影響，為探索其抗肺癌作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑亞硒酸鈉(sodium selenite)、二甲亞砜 (DMSO)、MTT，均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution, PBS)、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素雙抗，購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清(FBS)，購(gòu)自美國(guó)BBI Life Sciences公司；Hoechst 33342試劑盒，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒，購(gòu)自美國(guó)BD公司；活性氧(reactive oxygen species，ROS)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒，均購(gòu)自南京建成試劑公司；核蛋白提取試劑盒，購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司；裂解液、BCA蛋白試劑盒，購(gòu)自康為世紀(jì)生物公司；Keap1、Nrf2、血紅素加氧酶1(hemeoxygenase 1，HO-1)、β-actin、Lamin B抗體，均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司。

1.2人肺腺癌A549細(xì)胞的培養(yǎng)人肺腺癌A549細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。在37 ℃恒溫水浴箱中快速解凍A549細(xì)胞，將細(xì)胞接種于含有10% FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中(含100 U·L-1青霉素和100 U·L-1鏈霉素)，在37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，2～3 d傳代1次，傳代時(shí)用胰蛋白酶消化2 min，1 ∶3傳代，取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3細(xì)胞活力檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞(1×107·L-1)接種于96孔板中，每孔 200 μL，培養(yǎng)24 h，細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入100 μL含不同濃度藥物的培養(yǎng)液，用RPMI 1640無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋亞硒酸鈉，使其終濃度分別為2.5、5、10、15、20 μmol·L-1，空白對(duì)照組為RPMI 1640無(wú)血清培養(yǎng)液，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，各孔加入終濃度為5 g·L-1MTT液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，將原有孔中液體吸出，每孔加入150 μL DMSO，放在搖床上低速震蕩10 min，待紫色結(jié)晶物充分溶解后，置于多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司)上，檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm的吸光度值(optical density，OD)。抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD/空白對(duì)照組OD)×100%。

1.4細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞(1×109·L-1)接種在6孔板中，分為正常組和亞硒酸鈉組(2.5、5、10 μmol·L-1)，待細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行如下操作：① 使用倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)觀察無(wú)熒光染色的各組細(xì)胞狀態(tài)；② 每孔加入1 mL Hoechst 33342，室溫避光染色15 min，吸棄染色液，PBS液洗3次，每次5 min，置于倒置熒光顯微鏡，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.5細(xì)胞凋亡檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，用亞硒酸鈉(0、2.5、5、10 μmol·L-1)培養(yǎng)24 h后，用PBS洗滌細(xì)胞2次，胰蛋白酶消化后，收集細(xì)胞，離心吸棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC 結(jié)合液，輕輕重懸細(xì)胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，再加入10 μL碘化丙啶(PI)染色液，混合均勻。室溫避光孵育10～20 min，孵育過(guò)程中重懸細(xì)胞2～3次以改善染色效果，隨后置于冰浴中，立即用流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)檢測(cè)，AnnexinV-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

1.6氧化應(yīng)激參數(shù)檢測(cè)ROS是細(xì)胞在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的一系列活性氧簇， 是氧化應(yīng)激反應(yīng)的一個(gè)重要指標(biāo)。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物之一，常作為評(píng)判脂質(zhì)過(guò)氧化的指標(biāo)。ROS導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)是細(xì)胞凋亡中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，ROS的變化可以引發(fā)氧化還原反應(yīng)，從而影響MDA水平的變化，最終誘發(fā)細(xì)胞凋亡[7]。用熒光探針DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，用無(wú)血清的RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA，使工作液終濃度為20 μmol·L-1，37 ℃孵箱中避光溫育30 min，每個(gè)組別設(shè)6個(gè)復(fù)孔，置于激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm的多功能酶標(biāo)儀上檢測(cè)，并且通過(guò)激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)Zeiss公司)進(jìn)行熒光成像分析。

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞用亞硒酸鈉(0、2.5、5、10 μmol·L-1)處理24 h后，BCA法測(cè)定樣本蛋白濃度后，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，WST-1法檢測(cè)SOD活力，微量酶標(biāo)法檢測(cè)GSH含量，硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA含量。

1.7Westernblot檢測(cè)A549細(xì)胞經(jīng)藥物處理24 h后，終止細(xì)胞培養(yǎng)，吸除培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，每孔加入裂解液60 μL，置冰浴中裂解30 min，12 000 r·min-1離心7 min，獲得總蛋白樣品。根據(jù)核蛋白抽提試劑盒，獲取細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核蛋白。BCA比色法測(cè)蛋白濃度，蛋白定量后，在蛋白樣品中加入適量SDS-PAGE上樣緩沖液，100 ℃水浴變性10 min。取40 μg總蛋白上樣，經(jīng)8%或10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，用TBS-T稀釋的5%脫脂牛奶封閉2 h，加入抗體Keap1、Nrf2、HO-1、Lamin B和 β-actin，4 ℃孵育過(guò)夜(β-actin作為總蛋白和細(xì)胞質(zhì)中內(nèi)參蛋白，Lamin B作為細(xì)胞核中內(nèi)參蛋白)，TBS-T洗膜3次，每次10 min，加入對(duì)應(yīng)的熒光兔源或鼠源二抗，室溫孵育2 h，TBS-T洗膜3次，每次10 min，熒光影像分析儀(美國(guó)LI-COR公司)顯影和掃描。ImageJ 1.41軟件(美國(guó)Bethesda公司)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1亞硒酸鈉對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用Fig 1的MTT結(jié)果顯示，亞硒酸鈉具有抑制人肺腺癌A549細(xì)胞增殖的作用，隨著藥物濃度的增加，其抑制率也隨之增加(P<0.05)，提示亞硒酸鈉可抑制人肺腺癌A549細(xì)胞的增殖。

Fig 1 Inhibitory effects of sodium selenite on proliferation of A549

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

2.2亞硒酸鈉對(duì)A549細(xì)胞形態(tài)的影響未經(jīng)染色的人肺腺癌A549細(xì)胞見(jiàn)Fig 2A，隨著亞硒酸鈉濃度升高，變圓的細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，細(xì)胞貼壁能力變?nèi)?，漂浮?xì)胞數(shù)量增多，說(shuō)明凋亡細(xì)胞不斷增加。Hoechst 33342熒光染色結(jié)果如Fig 2B所示，正常組細(xì)胞核完整，熒光著色分布均勻，熒光呈彌散狀態(tài)，未出現(xiàn)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象；隨著亞硒酸鈉濃度的升高，細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，細(xì)胞染色質(zhì)呈顆粒熒光狀，細(xì)胞核呈折光性強(qiáng)的亮藍(lán)色小點(diǎn)，致密濃染，形態(tài)不規(guī)則且聚集成團(tuán)，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的典型特點(diǎn)，說(shuō)明亞硒酸鈉可誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。

2.3亞硒酸鈉對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響Fig 3的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，亞硒酸鈉可誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡，隨著亞硒酸鈉濃度的升高，凋亡細(xì)胞比例逐步增加，當(dāng)亞硒酸鈉濃度為10 μmol·L-1時(shí)，人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡率達(dá)到42.06%，與“2.2”結(jié)果相一致，進(jìn)一步說(shuō)明亞硒酸鈉具有誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的作用。

Fig 2 Effects of sodium selenite on morphology of A549 cells(×100)

A:Fluorescence photomicrograph of unstained A549 cells;B:Fluorescence photomicrograph of A549 cells stained with Hoechst 33342.

Fig 3 Effect of sodium selenite on apoptosis of A549

A:Effects of sodium selenite on apoptosis were determined using flow cytometry;B:Statistical analysis of the apoptotic rate.**P<0.01vscontrol group.

Fig 4 Effects of sodium selenite on oxidative stress of A549

A:ROS production was analyzed by laser confocal microscope(×200); B: ROS production was analyzed by multi-detection reader; C～E: Effects of sodium selenite on SOD,GSH and MDA activities.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

2.4亞硒酸鈉對(duì)氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響如Fig 4A、4B所示，ROS的水平與亞硒酸鈉的濃度呈依賴性關(guān)系。隨著亞硒酸鈉濃度的不斷增加，ROS的產(chǎn)生量逐漸升高，綠色熒光逐漸增加。與對(duì)照組相比，亞硒酸鈉組ROS的產(chǎn)生量明顯升高，其中高、中濃度組ROS的增加量較低濃度組更為明顯，說(shuō)明亞硒酸鈉誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡與氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，可能是通過(guò)促進(jìn)ROS產(chǎn)生來(lái)實(shí)現(xiàn)的。MDA為脂質(zhì)過(guò)氧化的代謝產(chǎn)物，其含量可以間接證明細(xì)胞氧化損傷的程度。SOD和GSH是體內(nèi)非常重要的抗氧化劑和自由基清除劑，其含量可以間接反映細(xì)胞抗氧化損傷的能力。如Fig 4C～4E所示，與對(duì)照組相比，亞硒酸鈉各組MDA含量均明顯升高(P<0.01)，亞硒酸鈉組SOD、GSH含量明顯減少(P<0.01)。

2.5亞硒酸鈉對(duì)Keap1/Nrf2/ARE信號(hào)通路的影響如Fig 5所示，經(jīng)過(guò)亞硒酸鈉處理的A549細(xì)胞，其Keap1、Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)明顯下降，蛋白的表達(dá)量與亞硒酸鈉濃度呈負(fù)相關(guān)，這也是亞硒酸鈉促進(jìn)人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡的重要原因。提示亞硒酸鈉通過(guò)調(diào)控Keap1/Nrf2/ARE信號(hào)通路，誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡。

2.6亞硒酸鈉對(duì)Nrf2在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中表達(dá)的影響如Fig 6所示，隨著亞硒酸鈉濃度的升高，A549細(xì)胞胞核中Nrf2蛋白表達(dá)明顯下降，細(xì)胞質(zhì)中Nrf2蛋白表達(dá)明顯上升，并且存在濃度依賴性。說(shuō)明亞硒酸鈉抑制Nrf2從細(xì)胞質(zhì)中遷移至細(xì)胞核，從而抑制Nrf2入核與下游的多效應(yīng)靶基因ARE結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物包括SOD、HO-1等多種抗氧化酶的表達(dá)降低，這與Fig 5結(jié)果相一致。因此，亞硒酸鈉誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡的機(jī)制與Keap1/Nrf2/ARE信號(hào)通路有關(guān)，同時(shí)可以抑制Nrf2發(fā)生核移位。

3 討論

肺癌是高發(fā)病率、高死亡率、預(yù)后最差的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人們的健康[8]。目前，臨床上的抗腫瘤藥物多數(shù)表現(xiàn)為價(jià)格昂貴、毒副作用大等缺點(diǎn)[9]，因此，尋找高效并且低毒的抗腫瘤藥物將成為國(guó)內(nèi)外研究的重點(diǎn)。硒是動(dòng)物的必需礦物質(zhì)元素，是谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的組成成分之一，可以保護(hù)細(xì)胞膜免受過(guò)氧化物的損害，作為自由基的捕獲劑，能夠防癌治癌，參與輔酶A和輔酶Q的生物合成過(guò)程，促進(jìn)丙酮酸脫羧反應(yīng)的進(jìn)行[10]。除此之外，硒與許多生理生化過(guò)程密切相關(guān)，包括氧化還原穩(wěn)態(tài)的生物合成，跨膜的離子通量調(diào)節(jié)和角蛋白完整性的維持[11]。

Fig 5 Effects of sodium selenite on protein expressions of Keap1/Nrf2/ARE pathway in A549

**P<0.01vscontrol group

Fig 6 Effects of sodium selenite on cytoplasmic and nuclear protein levels of Nrf2 in A549

**P<0.01vscontrol group

本研究MTT檢測(cè)顯示，亞硒酸鈉對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞的增殖具有抑制作用。通過(guò)倒置熒光顯微鏡對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、Annexin V-FITC/PI流式分析，證實(shí)了亞硒酸鈉具有促進(jìn)人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡的作用。從以上結(jié)果分析，亞硒酸鈉可能通過(guò)對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

氧化應(yīng)激相關(guān)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，亞硒酸鈉可能通過(guò)消耗A549細(xì)胞中的SOD和GSH含量，降低其抗氧化能力，誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，同時(shí)產(chǎn)生大量的ROS，導(dǎo)致細(xì)胞MDA含量增加，從而抑制了人肺腺癌A549細(xì)胞增殖。說(shuō)明亞硒酸鈉對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞的殺傷能力與細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)之間存在一定的相關(guān)性。

Keap1/Nrf2/ARE信號(hào)通路是迄今為止最重要的抗氧化通路[12]，參與體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)[13]。Nrf2與Keap1解離后進(jìn)行活化，活化后的Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與ARE相結(jié)合，啟動(dòng)下游Ⅱ相解毒酶、抗氧化蛋白類、蛋白酶體以及泛素酶的基因表達(dá)[14]。Western blot結(jié)果顯示，亞硒酸鈉下調(diào)人肺腺癌A549細(xì)胞中Keap1、Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)，并且隨著亞硒酸鈉濃度的增加，Keap1、Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)降低。同時(shí)細(xì)胞核中Nrf2蛋白表達(dá)隨著亞硒酸鈉濃度的增加而降低，而細(xì)胞質(zhì)中Nrf2蛋白表達(dá)與其相反。這說(shuō)明亞硒酸鈉致人肺腺癌A549細(xì)胞的凋亡可能與Keap1/Nrf2/ARE信號(hào)通路有關(guān)，并且該通路發(fā)揮作用的機(jī)制可能與亞硒酸鈉抑制Keap1/Nrf2/ARE中Nrf2發(fā)生核轉(zhuǎn)位密切相關(guān)。

綜上所述，亞硒酸鈉通過(guò)抑制人肺腺癌A549細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)控Keap1/Nrf2/ARE抗氧化信號(hào)通路，從而促進(jìn)人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡，這對(duì)亞硒酸鈉在腫瘤防治方面的研究具有重要的指導(dǎo)意義。此外，本研究初步探索了亞硒酸鈉誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡的作用及可能的分子機(jī)制，以期為亞硒酸鈉臨床用藥提供可靠的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。