黃順紅

(1. 湖南有色金屬研究院，長沙 410015；2. 中南大學 冶金科學與工程學院，長沙 410083)

土著微生物原位修復(fù)鉻渣堆場污染土壤的條件優(yōu)化

黃順紅1,2

(1. 湖南有色金屬研究院，長沙 410015；2. 中南大學 冶金科學與工程學院，長沙 410083)

通過對培養(yǎng)基的優(yōu)化，提出并研究直接添加培養(yǎng)基激活土著微生物的活性來進行鉻渣堆場污染土壤的原位微生物修復(fù)新方法，并探討土壤環(huán)境對土著微生物修復(fù)Cr(Ⅵ)效果的影響。研究表明：在每千克土壤中碳源葡萄糖投加量為5 g、氮源化合物A投加量為5 g、溫度為30 ℃、土與液質(zhì)量比為1:1的情況下，土著微生物可被迅速激活，在第4天時能基本去除土壤的中水溶性Cr(Ⅵ)；培養(yǎng)基初始pH值和不添加無機鹽氯化鈉不影響其修復(fù)效果。

鉻渣堆場；鉻污染；土著微生物；原位修復(fù)

土壤中鉻污染的修復(fù)面臨著嚴峻的挑戰(zhàn)。去除土壤中毒性 Cr(Ⅵ)的傳統(tǒng)方法有化學固定法、化學還原法、土壤淋洗法和電動修復(fù)法等。然而，這些傳統(tǒng)方法大多數(shù)需要高能耗或者需要大量的化學試劑，因而，這些方法成本高且易造成二次污染[1?3]。近年來，微生物修復(fù)法由于具有環(huán)境友好性及其成本較低等獨特的優(yōu)點而受到許多學者的關(guān)注。微生物修復(fù)土壤鉻污染主要是利用土壤中的土著微生物或加入經(jīng)馴化的高效微生物，通過微生物還原反應(yīng)，將有毒的、可移動的Cr(Ⅵ)還原為低毒的、不易移動的 Cr(Ⅲ)，達到治理土壤鉻污染的目的[4?6]。而應(yīng)用土著微生物進行有毒廢物解毒與污染土壤修復(fù)在環(huán)境安全性、環(huán)境適應(yīng)性與種群協(xié)調(diào)性以及應(yīng)用成本方面具有其他異地菌種不可比擬的優(yōu)越性[7]。

環(huán)境中存在著大量土著微生物，某些微生物對污染物具有一定凈化作用，但其自然凈化的速度一般較慢，其原因是由于其生存環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏[8?10]，而另一個限制因子是有效微生物常常生長較為緩慢。為了快速去除污染物，常常采取許多強化措施，例如提供電子受體，添加 N和 P等營養(yǎng)物質(zhì)來刺激微生物的生長[11?14]。

本文作者利用鉻渣堆場土壤中生活的有還原Cr(Ⅵ)功能的土著微生物，通過直接添加營養(yǎng)物質(zhì)，激發(fā)鉻還原菌的活性，進行鉻渣堆場鉻污染土壤修復(fù)。為了提高其修復(fù)效果，對不同碳源、pH、溫度和土壤濕度等條件下Cr(Ⅵ)的還原特性進行了研究，并優(yōu)化Cr(Ⅵ)的生物還原條件。

1 實驗

1.1 實驗原料

1.1.1 培養(yǎng)基

稱取葡萄糖5.0 g，氮源化合物A 5.0 g，溶于1 000 mL蒸餾水中，用NaOH和HCl調(diào)節(jié)pH至9.8左右，于121 ℃滅菌30 min，冷卻后備用。

1.1.2 土著微生物

土著微生物為本課題組從中國五礦( 湖南)鐵合金集團鉻渣堆場土壤中自行分離的Cr(Ⅵ)還原菌， 鑒定為 Pannonibacter phragmitetus，命名為 BB[15?17]。

1.1.3 土壤樣品

土壤樣品采自于某鉻渣堆場表層土壤(0～20 cm)。用塑料鏟子采集10 kg土壤，于室溫下自然風干，剔除草根、石塊及其他雜質(zhì)，充分混勻，用研缽磨細，過孔徑0.25 mm的篩。根據(jù)我國土壤分類標準，實驗用土壤屬于第四紀紅土發(fā)育的紅壤。

土壤基本理化性質(zhì)按常規(guī)分析方法測定，其結(jié)果如表1所列。

表1 鉻渣堆場土壤的基本理化性質(zhì)Table 1 Some physical and chemical properties of soil under chromium-containing slag heap

1.2 碳源對土著微生物修復(fù)鉻污染土壤的影響

1.2.1 不同碳源的影響

分別稱取葡萄糖和乳酸鈉各5 g，溶于1 000 mL蒸餾水中，每瓶中加入氮源化合物A 5 g，氯化鈉2 g，用NaOH和HCl調(diào)節(jié)pH至9.8，于121 ℃滅菌30 min，冷卻，制成液體培養(yǎng)基。以不加碳源作為對照。

稱取10 g鉻渣堆場土壤于滅菌的錐形瓶中，加入10 mL上述液體培養(yǎng)基(土壤中碳源投加濃度為5×10?3)，用透氣封口膜封口，稱取質(zhì)量，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間，每隔2 d用滅菌水補充蒸發(fā)損失的水分，于0、1、2、3、4和5 d取樣分析土壤中水溶性Cr(Ⅵ)含量的變化情況。

1.2.2 碳源量的影響

篩選出較好碳源，按上述操作配制液體培養(yǎng)基，使碳源濃度分別為3、5、8、11和13 g/L。每千克土壤中碳源投加濃度分別為3、5、8、11和13 g(即濃度分別為 0、3×10?3、5×10?3、8×10?3、11×10?3和13×10?3)，其余操作同上。

1.3 氮源化合物 A對土著微生物修復(fù)鉻污染土壤的影響

在篩選出最優(yōu)碳源和最佳碳源量的基礎(chǔ)上，配制液體培養(yǎng)基，改變氮源化合物A的含量，使其濃度分別為0、3、5、7、9和11 g/L?？疾觳煌瑪?shù)量的氮源化合物A對土著微生物P. phragmitetus BB修復(fù)鉻渣堆場污染土壤的效果，每千克土壤中氮源投加量分別為 0、3、5、7、9 和 11 g(即濃度分別為 0、3×10?3、5×10?3、7×10?3、9×10?3和 11×10?3)，其余操作同上。

1.4 無機鹽的影響

以最佳碳源及氮源化合物A配制液體培養(yǎng)基，一份培養(yǎng)基不加無機鹽，另一份培養(yǎng)基加入2 g/L氯化鈉。分別加入兩種不同處理的液體培養(yǎng)基10 mL于10 g污染土壤中，使每千克土壤中氯化鈉含量分別為 0和2 g，考察不同鹽含量對土著微生物P. phragmitetus BB修復(fù)鉻渣堆場污染土壤的影響，其余操作同上。

1.5 培養(yǎng)基pH的影響

改變培養(yǎng)基pH值，使液體培養(yǎng)基分別為6、7、8、9、10和 11，考察培養(yǎng)基 pH值對土著微生物 P.phragmitetus BB修復(fù)鉻渣堆場污染土壤的影響，其余操作同上。

1.6 溫度的影響

改變土壤體系溫度，考察 4個溫度 10、20、30和40 ℃對土著微生物P. phragmitetus BB修復(fù)鉻渣堆場污染土壤的影響，其后操作同上。

1.7 土壤濕度的影響

選擇田間持水量為 60%和淹水狀態(tài)下(土與液質(zhì)量比 1:1)兩種土壤，考察土壤濕度對土著微生物P. phragmitetus BB修復(fù)鉻渣堆場污染土壤的影響，其余操作同上。

1.8 土壤中不同形態(tài)Cr的提取及測定

土壤中總Cr。稱取土壤樣品0.3 g置于聚四氟乙烯坩堝中，加入10 mL濃硝酸，5 mL 體積比為1:l的硫酸和5 mL氫氟酸，在沙浴上消化，控制溫度不超過240 ℃。消解液中的鉻含量用ICP-AES測定。

土壤中總Cr(Ⅵ)。稱取2.5 g土樣于250 mL三角瓶中，加入 50 mL 0.28 mol/L Na2CO3+0.50 mol/L NaOH，加入0.4 g MgCl2，加入0.5 mol/L 0.5 mL磷酸鹽緩沖液(0.5 mol/L K2HPO4/KH2PO4)，攪拌5 min。樣品在90～95 ℃下持續(xù)加熱60 min，并不斷攪拌。慢慢冷卻至室溫，過濾，濾液采用二苯碳酰二肼分光光度法測定[18]。

土壤中水溶性Cr(Ⅵ)。將每次取的樣品，加入 50 mL去離子水，于振蕩器中振蕩1 h，離心，上清液采用二苯碳酰二肼分光光度法測定[19]。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有的試驗重復(fù)進行 3 次。數(shù)據(jù)采用 Microsoft Excel 2003和SPSS 14.0 統(tǒng)計軟件處理，采用 LSD 法對數(shù)據(jù)進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源的影響

碳源是影響微生物還原 Cr(Ⅵ)的一個極為重要的因素，它不僅可以為微生物提供必要的營養(yǎng)物質(zhì)，還可為微生物還原Cr(Ⅵ)提供電子供體。

由圖1可知，在第4天時，添加了葡萄糖和乳酸鈉處理后，土壤中水溶性 Cr(Ⅵ)濃度從初始的381.3×10?6分別降至 5.5×10?6和 43.3×10?6，Cr(Ⅵ)的去除率分別達到了99%和89%。比不添加碳源處理的去除率分別高出64%和54%。這表明，在有氮源提供的前提下，土著微生物能充分利用土壤組分中現(xiàn)有的一些有機物作為自己的碳源，進行土壤 Cr(Ⅵ)的還原，當土壤中有限的能利用的有機物消耗殆盡時，還原反應(yīng)也就停止。添加了碳源的兩組處理，其還原效果明顯提高，這說明兩種碳源葡萄糖和乳酸鈉都能促進菌體對 Cr(Ⅵ)的還原。其中，添加葡萄糖的處理效果有于乳酸鈉的。

本研究還考察葡萄糖添加量對污染土壤中Cr(Ⅵ)還原效果的影響，其結(jié)果如圖2所示。隨著葡萄糖添加量的增加，還原反應(yīng)的速率明顯加快。但在第4天，土壤中葡萄糖的含量為 5×10?3、7×10?3、9×10?3和11×10?3時，土壤中水溶性 Cr(Ⅵ)去除率均達到 98%以上。因此，從經(jīng)濟上考慮，用土著微生物修復(fù)Cr(Ⅵ)污染土壤時，葡萄糖的濃度以5×10?3為宜。

圖1 碳源對土壤Cr(Ⅵ)還原效果的影響Fig.1 Effect of carbon source on Cr(Ⅵ) reduction

圖2 葡萄糖濃度對Cr(Ⅵ)還原效果的影響Fig.2 Effect of glucose concentration on Cr(Ⅵ) reduction

2.2 氮源添加量的影響

土壤中氮源可能比較缺乏，所以，必須另外添加氮源或者輔助營養(yǎng)源，有助于土著微生物修復(fù)鉻污染土壤。添加不同濃度氮源化合物A對土著微生物去除土壤中水溶性Cr(Ⅵ)的影響如圖3所示。加入了一定數(shù)量的氮源化合物A后，土壤中水溶性Cr(Ⅵ)的濃度均隨著培養(yǎng)時間的增加而減少，每千克土壤中氮源化合物A的添加量為5、7、9和11 g(即氮源化合物的濃度依次為 5×10?3、7×10?3、9×10?3和 11×10?3)時，土壤水溶性Cr(Ⅵ)在第4天基本上去除。未加氮源化合物A的處理，土壤水溶性Cr(Ⅵ)濃度也有一定程度降低，但降幅不大，5 d后，土壤中水溶性Cr(Ⅵ)僅去除20%。這說明，即使給土壤提供土著微生物足夠的碳源，土壤中本身的氮源也不足以滿足其執(zhí)行完全修復(fù) Cr(Ⅵ)污染的功能，就湖南某廠鉻渣堆場污染土壤來說，外加5 g氮源(氮源化合物A)就能使土著微生物基本去除鉻渣堆場污染土壤中水溶性Cr(Ⅵ)。

圖3 不同濃度的氮源化合物A對Cr(Ⅵ)還原效果的影響Fig.3 Effect of nitrogenous compound A concentration on Cr(Ⅵ) reduction

2.3 無機鹽的影響

一定濃度的無機鹽是微生物體內(nèi)生理活動正常進行所必需的條件，但是過高濃度的鹽會增加溶液的滲透壓，使細菌發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象，造成細胞脫水，因而會抑制微生物的生長。

本實驗以氯化鈉為無機鹽，不同鹽度條件下供試土壤水溶性Cr(Ⅵ)去除率的變化如圖4所示。土壤水溶性Cr(Ⅵ)的去除率均隨培養(yǎng)時間的增加而增加，在第4天時，Cr(Ⅵ)的去除率均達到98%以上，兩處理對Cr(Ⅵ)去除沒有明顯差異，這說明，投加的無機鹽對土壤水溶性Cr(Ⅵ)的去除率沒有影響。這是由于供試樣土壤取自鉻渣堆場，是一種高鹽度土壤，土壤自身環(huán)境中鹽度能滿足土著微生物生理功能的需要，同時，當投加2 g氯化鈉時，土著微生物對土壤Cr(Ⅵ)還原也沒有受到影響，這也說明土著微生物具有一定的抗鹽性能。其抗鹽機理，可能是由于其細胞膜上有反向的H+/Na+載體，可以將體內(nèi)過高的Na+排出，同時將外界的H+吸收以達到降低細胞質(zhì)pH的目的；或者可通過Na+/K+離子泵的主動運輸，排出多余的Na+而吸收K+，同樣可以降低細胞質(zhì)中的鹽濃度。

圖4 不同鹽度條件下土壤Cr(Ⅵ)的去除率Fig.4 Cr(Ⅵ) removal rate in soil at different salinities

圖5 初始培養(yǎng)基不同pH值條件下土壤Cr(Ⅵ)的去除率Fig.5 Cr(Ⅵ) removal rate of liquid initial medium at different pH values

2.4 培養(yǎng)基pH的影響

pH是反映微生物在一定環(huán)境條件下代謝活動的重要指標，pH對微生物還原Cr(Ⅵ)有重要影響。在用微生物還原法原位修復(fù)土壤時，調(diào)整土壤 pH比較困難的，因此，在比較不同酸堿度對微生物還原土壤Cr(Ⅵ)的影響時，只考察初始培養(yǎng)基的pH變化對土著微生物修復(fù)鉻渣堆場鉻污染土壤的影響(見圖5)。 經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，各初始液體培養(yǎng)基 pH處理，土著微生物對土壤Cr(Ⅵ)的還原效果沒有明顯的區(qū)別。第4天時，每個處理中土壤Cr(Ⅵ)的去除率都在98%左右，這與許多鉻還原菌處理廢水完全不同，這是由土壤自身的性質(zhì)所決定的。

我國土壤的酸堿反應(yīng)大多數(shù)在pH 4.5～8.5之間，在地理分布上具有“南酸北堿”的地帶性分布特點，長江以南土壤多為強酸性，湖南土壤以紅壤居多，紅壤pH在5.5～6.5之間。而本研究供試土壤來自湖南某廠鉻渣堆場，是高堿土壤，這是由于高堿性鉻渣長期淋溶作用，其含有的鈉離子逐漸聚積在其下的土層，使得本應(yīng)呈酸性的紅壤而演變?yōu)閴A化土壤。

同時，土壤是一個包含固、液、氣三相組成的多組分開放的生物地球化學系統(tǒng)，多組分土壤含有不同的緩沖體系，如碳酸鹽體系、硅酸鹽體系、交換性陽離子體系、鋁體系和有機酸體系，這些不同體系共同作用，使得土壤具有較強抵御酸、堿物質(zhì)，減緩 pH變化的能力，即具有對酸堿的緩沖性。因此，當有外加H+和OH?進入土壤體系時，土壤pH變化極為緩慢，土壤酸度變化可穩(wěn)定保持在一定范圍內(nèi)，這為土壤微生物的活動創(chuàng)造了一個良好、穩(wěn)定的土壤環(huán)境條件。當不同pH初始培養(yǎng)基加入到土壤中時，由于土壤巨大的緩沖性能，土壤 pH沒有產(chǎn)生劇烈的變化，基本維持在 9.8左右，且在土壤Cr(Ⅵ)還原過程中，土壤pH也沒有明顯的變化(見圖6)。

圖6 不同pH值初始培養(yǎng)基土壤中水溶性Cr(Ⅵ)還原過程中pH值的變化Fig.6 Change of pH value during Cr(Ⅵ) reduction by indigenous microorganism in soil added initial medium with different pH values

因此，在實際應(yīng)用中，可以不必調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH來進行微生物原位修復(fù)鉻污染土壤，因而大大節(jié)省人力和物力。

2.5 溫度的影響

土壤中的生物修復(fù)受一年中季節(jié)、氣溫的影響，微生物菌落保持迅速生長和良好活性需要一個相對適宜的溫度范圍，在較冷的天氣條件下生物修復(fù)不易進行。

不同溫度條件下供試土壤水溶性Cr(Ⅵ)去除率的變化如圖7所示。由圖7可知，Cr(Ⅵ)的還原效率隨著溫度的升高而提高，當溫度為30 ℃時，Cr(Ⅵ)的還原率最高，培養(yǎng)第4天時，土壤水溶性Cr(Ⅵ)去除率達到了97%；40 ℃條件下，土壤水溶性Cr(Ⅵ)還原率略次于30 ℃，第4天時，Cr(Ⅵ)的去除也達到了89%；10 ℃時，土壤Cr(Ⅵ)去除率最低，即使經(jīng)過5 d的培養(yǎng)，Cr(Ⅵ)的去除率僅34.6%。且隨著溫度的升高，微生物活性逐漸增強，去除率也逐漸升高。在實際土壤生物修復(fù)工程中，可以采用塑料薄膜覆蓋土壤堆，使土壤堆的溫度升高，且可以保濕，這樣進行原位處理的時間可以延長，延長了處理時間，為寒帶地區(qū)的生物修復(fù)措施提供了可行的依據(jù)。

圖7 不同溫度條件下土壤Cr(Ⅵ)的去除率Fig.7 Cr(Ⅵ) removal rate in soil at different temperatures

2.6 土壤濕度的影響

濕度也是限制微生物迅速轉(zhuǎn)化的因素，因為表層土壤常常被風干，不利于微生物生長，所以必須添加一定量的水分以保持適宜的濕度。

從圖8可以看出，在30 ℃、每千克土壤中氮源化合物A和葡萄糖投加量均為5 g的條件下，淹水狀態(tài)下(土與液質(zhì)量比為1:1)，土壤水溶性Cr(Ⅵ)含量逐漸減少，第4天時，水溶性Cr(Ⅵ)基本去除，而在土壤濕度為60%田間持水量的處理中，土壤水溶性Cr(Ⅵ)在整個培養(yǎng)期間一直都沒有明顯變化，土著微生物的生長與繁殖需要一定的水分，60%田間持水量的土壤濕度不利用其生長和繁殖，而且土壤水分太少，也不利于微生物的自由游動，這可能是導致60%田間持水量下供試土壤中水溶性 Cr(Ⅵ)在培養(yǎng)期間幾乎沒有被還原的重要原因之一。

圖8 土壤濕度對微生物還原土壤Cr(Ⅵ)的影響Fig.8 Effects of humidity on reduction of water soluble Cr(Ⅵ)in soil by microorganism

3 結(jié)論

1) 在溫度為30 ℃、每千克土壤中碳源葡萄糖投加量為5 g、氮源化合物A投加量5 g、水量充足(土與液的質(zhì)量比1:1)的條件下，土著微生物在第4天時，基本可去除鉻渣堆場土壤中水溶性Cr(Ⅵ)。

2) 培養(yǎng)基的不同初始pH不影響土著微生物還原功能的發(fā)揮，且在整個還原過程中，土壤 pH變化較小；外加無機鹽2 g沒有促進土著微生物還原Cr(Ⅵ)，在原位修復(fù)鉻渣污染土壤時，無需投加無機鹽；土壤60%的田間持水量時，土壤中水溶性 Cr(Ⅵ)在培養(yǎng)期間沒有被還原。

3) 湖南某廠鉻渣堆場土壤中存在具有鉻還原能力的土著微生物，直接向土壤中添加營養(yǎng)物質(zhì)可刺激土著微生物活性，進行鉻污染土壤的原位修復(fù)。

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Optimum condition of in-situ remediation of Cr(Ⅵ) polluted soil from chromium-containing slag heap by indigenous microorganism

HUANG Shun-hong1,2
(1. Hunan Research Institute of Nonferrous Metals, Changsha 410015, China;2. School of Metallurgical Science and Engineering, Central South University, Changsha 410083, China)

Based on the optimization of culture medium composition, the growth conditions and ability of Cr(Ⅵ)reduction, the in-situ remediation of Cr-contaminated soil can be achieved by adding culture medium in soils to stimulate the activity of indigenous microorganism. The results show that the optimal conditions for the Cr(Ⅵ) reduction by indigenous microorganism are 5 g glucose and 5 g nitrogenous compounds A per kilogram soil at 30 ℃ and the mass ratio of soil to water is 1:1. Under the optimal condition, the water soluble Cr(Ⅵ) in the soil contaminated by chromium-containing slag heap is completely removed in the fourth day. The initial pH value of culture medium do not affect Cr(Ⅵ) reduction. The inorganic salt does not need to be added into the culture medium when the in-situ remediation of Cr(Ⅵ) is carried out by the indigenous microorganism.

chromium-containing slag heap; Cr-contamination; indigenous microorganism; in-situ remediation

S154.36

A

1004-0609(2011)07-1741-07

湖南科技計劃重點資助項目(2008SK2007)；長沙市科技計劃資助項目(K0802144-31)

2010-09-28；

2010-12-12

黃順紅，工程師，博士；電話：0731-85239020；E-mail: hshunhong@163.com

(編輯 李艷紅)