王鳳榮 宋秀梅 張博雅 張永忠，2

亞臨界水提取大豆胚芽中異黃酮及低聚糖的研究

王鳳榮1宋秀梅1張博雅1張永忠1，2

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院1，哈爾濱 150030)
(教育部大豆生物學(xué)重點實驗室2，哈爾濱 150030)

以大豆胚芽為原料、高壓反應(yīng)釜為反應(yīng)容器，應(yīng)用亞臨界水為溶劑、采用高純氮氣加壓提取大豆胚芽中異黃酮及大豆低聚糖。利用紫外分光光度法測定大豆異黃酮的含量。選取液料比、提取時間、提取溫度、壓力4個因素進(jìn)行單因素試驗，再進(jìn)行正交試驗優(yōu)化亞臨界水提取大豆異黃酮的條件。結(jié)果表明:在液料比25∶1，浸提溫度120℃，浸提時間40 min，浸提壓力1．9 MPa的條件下，大豆異黃酮的得率是1．09%，大豆異黃酮粗提物的產(chǎn)率為6．52%，粗提物純度是2．60%;大豆低聚糖粗提物產(chǎn)率是35．2%。

亞臨界水 大豆胚芽 異黃酮 大豆低聚糖

12種大豆異黃酮中的染料木黃酮(genistein)和黃豆苷元(daidzein)具有多種生物活性和生理功能。美國國家癌癥研究所于1996年已將染料木黃酮列入腫瘤化學(xué)預(yù)防藥物臨床發(fā)展計劃之中，主要預(yù)防目標(biāo)是乳腺癌和前列腺癌［1］。它能抗氧化、消炎，有弱雌激素活性，能有效地預(yù)防和抑制各種腫瘤、骨質(zhì)疏松癥、婦女更年期綜合癥及心血管疾病等多種疾病的發(fā)生［2］。染料木黃酮在藥用機(jī)制方面具有不殺傷正常細(xì)胞的特點［3］，這在現(xiàn)有抗癌藥物中實屬罕見，因而受到各國醫(yī)藥界的關(guān)注。國外一直應(yīng)用染料木黃酮進(jìn)行臨床試驗研究［4－7］。國外對黃豆苷元的研究也取得了重要進(jìn)展。2010年伯克康奈爾醫(yī)學(xué)研究所、紐約亨特學(xué)院生物系，密歇根大學(xué)醫(yī)學(xué)院等發(fā)表了對黃豆苷元進(jìn)行臨床試驗研究的重要成果。這幾所研究機(jī)構(gòu)對一個含有2 000種FDA許可使用的藥物，天然產(chǎn)物和其它生物活性化合物的藥物庫中的化合物進(jìn)行篩選，結(jié)果表明黃豆苷元可通過非c AMP依賴途徑促進(jìn)神經(jīng)元的保護(hù)和再生，這一發(fā)現(xiàn)有望使它成為預(yù)防中風(fēng)和治療帕金森病的安全藥物［8］。

當(dāng)水在374．2℃和22．1 MPa以上的高溫、高壓條件下，可形成既非液體又非氣體的第4狀態(tài)，即所謂“超臨界狀態(tài)”。在此狀態(tài)下的水稱為“超臨界水”。在稍微低于此溫度和壓力下的水稱為“亞臨界水”［9］。研究表明，亞臨界流體物理、化學(xué)特性的改變主要源于介電常數(shù)的改變［10］。水的介電常數(shù)隨著溫度升高而降低，水在250℃時介電常數(shù)為27［11］，介于常溫常壓下乙醇(介電常數(shù)24)和甲醇(介電常數(shù)33)之間，由此可見通過升高亞臨界水的溫度可以改變水的極性、增加擴(kuò)散力、提高溶解度、降低黏度、降低表面張力、降低物理/化學(xué)結(jié)合力，從而提高其對中極性和非極性有機(jī)物的溶解能力，加快大豆異黃酮在亞臨界水中溶解的化學(xué)進(jìn)程。升高壓力有利于水進(jìn)入低壓時封閉的微孔，同時使水在高溫下仍保持液態(tài)并快速充滿萃取池，采用高純氮氣加壓可以防止提取過程中高溫下異黃酮被氧化，提高大豆異黃酮的得率。

大豆胚芽是豆制品工業(yè)的副產(chǎn)物之一。大豆異黃酮在大豆胚芽中的含量遠(yuǎn)高于大豆子葉和種皮中的含量，一般高出8～10倍。利用大豆胚芽為原料可以降低大豆異黃酮的生產(chǎn)成本。大豆胚芽中還含有較多的大豆低聚糖。大豆低聚糖是多羥基的醛或酮，可溶于水。在低聚糖水溶液中加入乙醇會破壞低聚糖與水形成的氫鍵，從而降低低聚糖在水中的溶解度，使低聚糖以沉淀的形式析出［12］。利用低聚糖溶于水而不溶于高濃度乙醇的性質(zhì)可使低聚糖沉淀出來得到大豆低聚糖粗提物［13］。分離亞臨界水浸提液中的大豆低聚糖，可以起到純化大豆異黃酮的作用。應(yīng)用亞臨界水為溶劑、采用高純氮氣加壓提取大豆胚芽中異黃酮及大豆低聚糖的研究在國內(nèi)還鮮有報道。本研究以亞臨界水為溶劑，應(yīng)用高純氮氣加壓，以大豆總異黃酮得率為指標(biāo)，應(yīng)用單因素和正交設(shè)計試驗優(yōu)化提取大豆異黃酮的工藝條件;再應(yīng)用醇沉法從提取液中分離出大豆低聚糖，建立了提取大豆異黃酮和大豆低聚糖的綜合工藝。

1 材料與方法

1．1 材料、試劑

大豆胚芽:哈高科大豆食品有限責(zé)任公司;染料木苷(Genistin)標(biāo)準(zhǔn)品:Sigma公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98．0%;高純氮氣:北京亞南氣體有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99．999%;其他試劑均為分析純。

1．2 試驗儀器

索氏提取器;高壓磁力攪拌反應(yīng)釜:煙臺高新區(qū)科立自控設(shè)備研究所;LG10－2．4A型高速離心機(jī);TU－1901雙光束紫外可見分光光度計:北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1．3 試驗方法

1．3．1 原料處理

將大豆胚芽粉進(jìn)行索氏脫脂7～8 h，脫脂后置于表面皿上自然干燥后備用。

1．3．2 亞臨界水法提取大豆異黃酮

將上述脫脂后的胚芽放入高壓反應(yīng)釜中，加入一定體積的蒸餾水，通入高純氮氣加壓，在磁力攪拌轉(zhuǎn)速為180 r/min下，一定的提取溫度下提取一定時間，得到提取液用熱水漏斗趁熱過濾。吸取一定量濾液用95%乙醇進(jìn)行定容稀釋到一定倍數(shù)后待測。

以染料木苷為標(biāo)準(zhǔn)品，在240～280 nm采用三波長紫外分光光度法［14］繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到A=0．427 3 x+0．002 6(R2=0．999 8)方程，式中 A 為吸光值，x為質(zhì)量濃度(μg/mL)。以上述待測液在特征吸收區(qū)吸收的強弱定量測定，計算大豆異黃酮的得率。

1．3．3 大豆異黃酮與大豆低聚糖的分離

應(yīng)用1．3．2得到的最佳工藝條件提取大豆異黃酮。首先將應(yīng)用高壓反應(yīng)釜提取后得到的浸提液經(jīng)熱水漏斗過濾，除去雜質(zhì)。然后將濾液減壓濃縮、冷卻后攪拌下加入無水乙醇使大豆低聚糖沉淀，經(jīng)布氏漏斗減壓過濾得大豆低聚糖產(chǎn)品。濾液水浴45℃下減壓蒸餾除去乙醇得到異黃酮濃縮液，再減壓真空干燥得到大豆異黃酮粗產(chǎn)品。

2 結(jié)果與分析

2．1 單因素試驗

2．1．1 液料比對大豆異黃酮得率的影響

在提取溫度110℃，提取時間30 min，反應(yīng)釜內(nèi)浸提壓力為0．1 MPa條件下，每個條件做3次重復(fù)試驗，考察亞臨界條件下液料比對大豆異黃酮得率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 液料比對大豆異黃酮得率的影響

由圖1可知，液料比與大豆異黃酮得率呈正相關(guān)，在液料比為30∶1的情況下，得率達(dá)到最高。原因是液料比過小，會出現(xiàn)糊底現(xiàn)象，容易使浸出的異黃酮黏在反應(yīng)釜內(nèi)壁上，不易轉(zhuǎn)移，易造成產(chǎn)品損失。應(yīng)用SPSS軟件得到的方差分析和多種比較結(jié)果表明，液料比為30∶1與35∶1兩處理間的差異達(dá)不到統(tǒng)計學(xué)意義的顯著水平，分別和 15∶1、20∶1、25∶1 三處理間的差異達(dá)到統(tǒng)計意義的顯著水平?？傻?，隨著液料比增大，大豆異黃酮得率增加。但大豆異黃酮總量是一定的，當(dāng)液料比繼續(xù)增大到35∶1，不能增加得率，而且后續(xù)脫溶會浪費大量能源，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。故選25∶1、30∶1、35∶1 共3 個水平作正交試驗。

2．1．2 提取時間對大豆異黃酮得率的影響

在提取溫度110℃，液料比30∶1，浸提壓力為0．1 MPa條件下，每個條件做3次重復(fù)試驗，考察亞臨界條件下提取時間對大豆異黃酮得率的影響。結(jié)果見圖2。

由圖2可知，時間與大豆異黃酮得率呈正相關(guān)，隨著提取時間的延長，大豆異黃酮得率迅速提高，30 min時達(dá)到最大值，此后緩慢下降。原因可能是原料或提取液中的異黃酮與高溫壁接觸的時間越長會導(dǎo)致大豆異黃酮部分分解。方差分析和多種比較結(jié)果表明，時間10、20 min兩處理間和30、40、50 min 3處理間都達(dá)不到統(tǒng)計學(xué)意義的顯著水平，但這兩組間達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義的顯著水平。故選擇20、30、40 min 3個水平作正交試驗。

圖2 提取時間對大豆異黃酮得率的影響

2．1．3 提取溫度對大豆異黃酮的得率影響

在提取時間30 min，液料比30∶1，浸提壓力為0．1 MPa條件下，每個條件做3次重復(fù)試驗，考察亞臨界條件下提取溫度對大豆異黃酮得率的影響。結(jié)果見圖3。

圖3 提取溫度對大豆異黃酮的得率影響

由圖3可知，大豆異黃酮的得率隨著溫度的升高而迅速增加，在110℃時達(dá)到最高，120℃時增加不明顯，大于120℃時得率明顯下降。原因可能是當(dāng)溫度低于100℃水還不是亞臨界水，對弱極性的異黃酮溶解能力較小。當(dāng)溫度高于120℃時，部分異黃酮可能被分解。方差分析和多種比較結(jié)果表明，110、120℃兩處理間與130、140℃兩處理間均達(dá)不到統(tǒng)計學(xué)意義上的顯著水平，100℃與110、120℃能達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義的顯著水平。故選100、110、120℃3個水平作正交試驗。

2．1．4 提取壓力對大豆異黃酮的得率影響

在提取溫度為110℃，時間30 min，液料比為30∶1的條件下，每個條件做3次重復(fù)試驗，考察亞臨界條件下壓力對大豆異黃酮得率的影響。結(jié)果見圖4。

圖4 提取壓力對異黃酮得率的影響

由圖4可知，大豆異黃酮的得率隨著壓力的升高而增大，且在反應(yīng)釜內(nèi)浸提壓力為1．5 MPa時達(dá)到最大值，升高壓力有利于溶劑進(jìn)入低壓時封閉的微孔，同時使溶劑在高溫下仍保持液態(tài)。方差分析和多種比較結(jié)果表明，1．5 MPa 分別與 1．1、1．9 MPa達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義的顯著水平，0．3、0．7、1．1 MPa 3 處理間未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義的顯著水平。故選擇1．1、1．5、1．9 MPa 3 個水平作正交試驗。

2．2 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，對影響大豆異黃酮提取物得率的因素進(jìn)行L9(34)正交試驗，因素水平見表1，試驗結(jié)果見表2。

由表2可見，影響大豆異黃酮的因素主要次序為A＞C＞D＞B，其中液料比和溫度對得率影響顯著，最佳組合為A1B3C3D3，即液料比25∶1，浸提時間為40 min，浸提溫度120℃，浸提壓力1．9 MPa。

表1 因素水平表

表2 正交試驗結(jié)果

2．3 與醇提法對比試驗結(jié)果

由表3可知，與醇提法相比，亞臨界水法提取大豆胚芽中的異黃酮得率明顯提高，而且提取時間大大縮短。另外亞臨界水法用的溶劑是水，綠色環(huán)保、成本低。說明采用亞臨界水法提取大豆胚芽中的異黃酮節(jié)能省時，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。

表3 對比試驗結(jié)果

2．4 異黃酮與低聚糖的分離及驗證試驗

按正交試驗確定的最佳條件進(jìn)行平行驗證試驗3次。取大豆胚芽8．000 g，脫脂后以25∶1的液料比放入高壓反應(yīng)釜內(nèi)，通入高純氮氣使壓力達(dá)到1．9 MPa，在溫度120℃下提取40 min。得到的浸提液經(jīng)熱水漏斗過濾，除去雜質(zhì)。將濾液減壓濃縮約至10 mL，冷卻后攪拌下加入190 mL無水乙醇得到大豆低聚糖沉淀。經(jīng)布氏漏斗減壓過濾得大豆低聚糖產(chǎn)品，真空干燥后稱得產(chǎn)品2．819 4 g，大豆低聚糖的粗提物產(chǎn)率為35．2%，濾液在45℃下減壓蒸餾除去乙醇得到異黃酮濃縮液，再減壓真空干燥得到大豆異黃酮粗產(chǎn)品0．521 7 g，產(chǎn)率為6．52%，粗產(chǎn)品純度為2．60%。

3 結(jié)論

通過單因素試驗和正交試驗確定亞臨界水法提取大豆異黃酮的最優(yōu)條件為:液料比25∶1，浸提時間40 min，浸提溫度120℃，浸提壓力1．9 MPa。應(yīng)用亞臨界水為溶劑、采用高純氮氣加壓提取大豆胚芽中異黃酮及低聚糖在最佳條件下大豆異黃酮的得率為1．09%，異黃酮的粗提物產(chǎn)率為6．52%，純度為2．60%，大豆低聚糖粗提物產(chǎn)率為35．2%。

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Study on Sub－critical Water Extraction of Isoflavones and Soybean Oligosaccharides from Soybean Germ

Wang Fengrong1Song Xiumei1Zhang Boya1Zhang Yongzhong1，2
(College of Science，Northeast Agricultural University1，Harbin 150030)
(Key Laboratory of Soybean Biology，Ministry of Education2，Harbin 150030)

The native potato starch was carboxymethylated through microwave radiation Tech－nology．Based on single factor experiments，a series of central composite design experiments were conducted for an optimal synthesis process．CH2ClCOOH，NaOH，time of etherification and ethanol concentration were selected as variables and a mathematical regression model for degree of substitution was developed．Finally，the optimal extraction process was obtained as follows:etherification time 25 min，ethanol concentration 83．86%，nClCH2COOH∶nAGU=0．768∶1，and nNaOH∶nAGU=2．597∶1．Under such conditions，the DSwas up to 0．325．

carboxymethylation，potato starch，microwave，response surface methodology

A

1003－0174(2011)11－0032－05

863計劃(2008AA10Z331)

2011－02－24

王鳳榮，女，1986年出生，碩士，食品化學(xué)與營養(yǎng)

張永忠，男，1953年出生，教授，碩士生導(dǎo)師，應(yīng)用化學(xué)