梁巧蘭， 王 芳， 魏列新， 徐秉良

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院／草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，蘭州 730070）

百合疫霉（Phytophthor a nicotianae Bredeet de Haan）是危害百合莖基部的主要病原菌，引起百合疫病。近年來在百合種植區(qū)發(fā)生普遍，大棚種植區(qū)發(fā)病率為11．8%，而露地種植區(qū)發(fā)病率為19．1%，嚴(yán)重影響百合產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益［1］。目前，采用化學(xué)藥劑防治效果不理想，同時還引起農(nóng)藥殘留、農(nóng)藥污染及抗藥性菌株出現(xiàn)等問題，因此，有必要大力開展生物防治植物病害研究。

木霉 （Trichoder ma spp．）是一類較理想的生防菌。人們已相繼發(fā)現(xiàn)木霉對18個屬29種病原真菌表現(xiàn)出拮抗作用［2］，其中對一些土傳植物病原菌具有很好的防治效果，包括絲核菌屬（Rhizoctonia）、小核菌屬（Sclerotium）、鐮刀菌屬（Fusariu m）、腐霉屬（Pythiu m）、疫霉屬（Phytophthor a）等12個屬的病原菌［3－4］。木霉的作用機(jī)制包括抗生、寄生、溶菌、競爭和誘導(dǎo)抗性，并具有促進(jìn)植物生長的作用［3］。木霉用于防治百合疫霉病的研究國內(nèi)外尚未見報道。為此，對具有拮抗作用的深綠木霉（Trichoderma atroviride）對百合疫霉拮抗作用及其機(jī)制進(jìn)行了研究，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

深綠木霉T2菌株、百合疫霉由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實驗室分離保存；培養(yǎng)基：PDA（馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基）、PDB（馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基）。

1．2 試驗方法

1．2．1 深綠木霉T2菌株與百合疫霉菌對峙培養(yǎng)

制備PDA培養(yǎng)基，將培養(yǎng)2 d、直徑為5 mm的深綠木霉菌塊與百合疫霉菌塊對接于直徑90 mm的培養(yǎng)皿邊緣，另將深綠木霉、百合疫霉菌塊分別接于培養(yǎng)皿中央的純培養(yǎng)作為對照，每處理設(shè)6個重復(fù)。28℃恒溫培養(yǎng)，定期觀察兩菌的生長情況，記錄生長半徑。

1．2．2 深綠木霉T2菌株對百合疫霉菌拮抗作用方式觀察

在PDA培養(yǎng)基中央放置一塊20 mm×20 mm無菌蓋玻片，在左側(cè)距蓋玻片40 mm處接種深綠木霉，右側(cè)距蓋玻片20 mm處接種百合疫霉。28℃恒溫培養(yǎng)。設(shè)置12個重復(fù)。分別在兩種菌培養(yǎng)24、36、48、60 h時，取下蓋玻片，放在載玻片上，顯微觀察兩種菌絲之間的作用方式，并用數(shù)碼顯微照相儀照相。

1．2．3 深綠木霉T2菌株發(fā)酵液對百合疫霉病菌菌絲的抑制作用

將培養(yǎng)3 d的深綠木霉發(fā)酵液8 000 r／min離心10 min，分別將15 mL上清液倒入培養(yǎng)皿中，接入百合疫霉菌塊。淺層培養(yǎng)5 d后觀察性狀。以滅菌的上清液中培養(yǎng)百合疫霉菌塊為對照。每處理設(shè)6個重復(fù)。

1．2．4 深綠木霉T2菌株代謝產(chǎn)物對百合疫霉病菌抗生作用

1．2．4．1 深綠木霉T2菌株發(fā)酵液對百合疫霉病菌的抗生作用

試驗設(shè)PDB直接發(fā)酵和在PDB中加入20 g百合疫霉干菌絲進(jìn)行發(fā)酵2個處理，在裝有100 mL上述2種PDB的三角瓶中分別接入直徑5 mm深綠木霉T2菌塊。在28℃、150 r／min條件下發(fā)酵，設(shè)6個重復(fù)，分別于2、4、7 d取樣，在無菌條件下將發(fā)酵液先用濾紙過濾，再用直徑35 mm的細(xì)菌過濾器過濾，將10 mL兩種濾液分別加入90 mL PDA中（50℃左右），搖勻倒成平板，接上直徑5 mm的百合疫霉菌塊，設(shè)置6個重復(fù)。28℃恒溫培養(yǎng)，5 d時觀察、測量并記錄生長情況。

1．2．4．2 深綠木霉T2菌株易揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對百合疫霉的拮抗作用

對扣培養(yǎng)法測定［5］：在PDA平板上接種已活化2 d、直徑為5 mm的深綠木霉菌塊，28℃恒溫培養(yǎng)2d后，在其上方蒙上雙層無菌的圓形玻璃紙（玻璃紙直徑比培養(yǎng)皿直徑大10 mm），再將剛接種過直徑為5 mm百合疫霉菌塊的PDA平板（與接種深綠木霉菌塊的PDA同樣大?。┑箍燮渖?，封口膜密封后，28℃恒溫培養(yǎng)。以空白PDA平板與百合疫霉平板對扣培養(yǎng)作對照。設(shè)6個重復(fù)。接種后每隔24 h用十字法交叉測量百合疫霉菌落大小，計算其菌絲生長抑制率，連續(xù)測5 d。菌絲生長抑制率計算方法如下：

1．2．4．3 深綠木霉T2菌株難揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對百合疫霉的拮抗作用

圓盤濾膜 法 測 定［5－6］：鋪雙層無菌玻璃紙于PDA平板上，在玻璃紙中央接種已活化2 d、直徑為5 mm的深綠木霉菌塊，28℃恒溫培養(yǎng)。設(shè)置6個重復(fù)。待深綠木霉菌絲長滿玻璃紙前，將玻璃紙移去。在平板中央接種已活化5 d的百合疫霉菌塊，28℃下恒溫培養(yǎng)。以不接深綠木霉菌塊的PDA平板接種百合疫霉作對照。接種后每隔24 h用十字交叉法測定菌落直徑，計算其菌絲生長抑制率，計算方法同上。

1．3 深綠木霉T2菌株溶菌酶β－1，3－葡聚糖酶活性的測定

待測酶液的準(zhǔn)備：將1～8 d的深綠木霉發(fā)酵液，8 000 r／min離心20 min去除菌絲，以上清液作為酶液放置于4℃冰箱中備用。

發(fā)酵液中β－1，3－葡聚糖酶活力的測定：參考El Ghaouth［7］和中國科學(xué)院上海植物生理研究所［8］的方法進(jìn)行，每處理3個重復(fù)，每個重復(fù)測5次，以每s產(chǎn)生還原糖1 n mol的酶量為1個酶活單位（U）。

2 結(jié)果與分析

2．1 深綠木霉T2菌株對百合疫霉菌拮抗作用

對峙培養(yǎng)中兩菌的生長速率均比各自在單獨培養(yǎng)時有所減弱，但深綠木霉T2生長速率隨培養(yǎng)時間的延長逐漸增大，與純培養(yǎng)的生長勢相同；而百合疫霉的生長速率逐漸減小，與純培養(yǎng)的生長勢相反。并且在對峙培養(yǎng)60 h時，深綠木霉T2與百合疫霉的生長速率比值達(dá)到3．68，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于純培養(yǎng)中兩者的比值2．36（圖1）。

圖1 深綠木霉、百合疫霉生長速率比較

PDA平板上的深綠木霉T2與百合疫霉接觸后，兩者菌絲在交界處互相纏繞，深綠木霉T2的菌絲在百合疫霉菌落邊緣菌絲上打成許多綠色結(jié)。且深綠木霉T2相對于百合疫霉來說，生長速度要快得多，覆蓋了平板的4／5（圖2a），表明深綠木霉T2在營養(yǎng)和空間上具有明顯的競爭優(yōu)勢。

深綠木霉對百合疫霉拮抗作用方式研究表明：24 h時深綠木霉T2與百合疫霉菌各自生長，在蓋玻片邊緣均能看到兩菌菌絲，但還未接觸，只是深綠木霉菌絲較百合疫霉菌絲長，且數(shù)量多。36 h時在顯微鏡下可以觀察到兩者菌絲相接觸，但接觸面小，從外觀上還看不到木霉抑制疫霉生長的現(xiàn)象；到48 h時便可以明顯看到深綠木霉T2沿著百合疫霉菌絲或纏繞在百合疫霉菌絲上生長，并在疫霉菌絲上產(chǎn)生大量的分支，此時深綠木霉T2已經(jīng)產(chǎn)生吸器伸入到疫霉菌絲內(nèi)（圖2b，c）；60 h時深綠木霉T2明顯抑制了百合疫霉菌絲的生長，其菌絲降解、不能繼續(xù)擴(kuò)張（圖2d）。

2．2 深綠木霉T2菌株發(fā)酵液對百合疫霉病菌菌絲的抑制作用

在未滅菌的深綠木霉T2上清液中培養(yǎng)的疫霉菌塊，僅在初期長出細(xì)小菌絲后便無法繼續(xù)生長，而在滅菌后的上清液中，疫霉菌塊仍可以繼續(xù)生長，形成大塊菌絲團(tuán)。從而證實深綠木霉發(fā)酵液能夠抑制百合疫霉菌絲（圖2e）。

2．3 深綠木霉T2菌株對百合疫霉病菌抗生作用測定

10%深綠木霉T2發(fā)酵液對百合疫霉的抑制效果隨發(fā)酵時間的延長而逐漸增強，其中發(fā)酵2 d的抑制效果為31．17%，而發(fā)酵7 d的抑制率已升至46．61%。說明深綠木霉能夠通過產(chǎn)生抗生物質(zhì)來抑制百合疫霉菌的生長。但在加有百合疫霉菌絲的PDB中進(jìn)行發(fā)酵處理時，與PDB發(fā)酵相比，其抑制率呈遞減的趨勢，發(fā)酵7 d的抑制率僅為用PDB發(fā)酵的31．43%，這表明百合疫霉菌絲對深綠木霉產(chǎn)生抗生物質(zhì)并沒有誘導(dǎo)作用（表1）。方差分析表明2、4、7 d的深綠木霉PDB發(fā)酵液和含有百合疫霉菌絲的深綠木霉PDB發(fā)酵液對百合疫霉的抑制率之間均存在極顯著差異（圖2f，g）。

表1 10%深綠木霉發(fā)酵液對百合疫霉病菌的抑制效果1）

2．4 深綠木霉T2菌株代謝產(chǎn)物對百合疫霉的拮抗作用

圓盤濾膜法和對扣培養(yǎng)法培養(yǎng)結(jié)果表明，深綠木霉T2產(chǎn)生的難揮發(fā)性和易揮發(fā)代謝產(chǎn)物對百合疫霉菌絲生長均有明顯的抑制作用，且在72 h時抑菌率均達(dá)到最大值，分別為88．24%和80．00%，以后菌落直徑不再增大。方差分析表明深綠木霉兩種代謝產(chǎn)物在24 h和72 h對百合疫霉抑菌率均存在極顯著差異，難揮發(fā)代謝產(chǎn)物48 h的抑菌率介于兩者之間，易揮發(fā)代謝產(chǎn)物48 h的抑菌率和72 h的差異不顯著（圖2h，i，表2）。

圖2 深綠木霉T2對百合疫霉的拮抗作用

表2 深綠木霉代謝產(chǎn)物對百合疫霉菌的影響1）

2．5 深綠木霉T2菌株溶菌酶β－1，3－葡聚糖酶活性測定

深綠木霉T2發(fā)酵液中可產(chǎn)生能夠溶解真菌細(xì)胞壁的β－1，3－葡聚糖酶，且發(fā)酵時間對酶活性有一定影響。隨著發(fā)酵時間的延長，酶活整體呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢。在5 d達(dá)到峰值，為18．54 U（圖3）。

圖3 發(fā)酵時間與β－1，3葡聚糖酶活性的關(guān)系

3 討論

據(jù)報道木霉菌的有些種如綠色木霉（Trichoderma viride）和哈茨木霉（T．har zianu m）的拮抗機(jī)制主要是通過重寄生發(fā)揮其防病作用［9］。辛雅芬等［10］研究認(rèn)為拮抗木霉菌的生防機(jī)制包括競爭作用、重寄生作用、抗生作用、誘導(dǎo)抗病性和協(xié)同拮抗作用。李梅云等［11］研究發(fā)現(xiàn)不同木霉菌株對同一病原菌的作用機(jī)制不同，如木霉菌株TR13、TR14、TR17對煙草疫霉（Phytophthora parasitica var．nicotianae）的作用機(jī)制中TR13、TR14的競爭作用較好；3個木霉菌株均產(chǎn)生β－1，3葡聚糖酶、纖維素酶并參與煙草疫霉細(xì)胞壁的消解，以TR13與TR14酶的活性較高；本研究也發(fā)現(xiàn)競爭作用、重寄生作用、抗生作用和溶菌作用是深綠木霉T2對百合疫霉拮抗作用的主要機(jī)制；另外，深綠木霉T2產(chǎn)生的β－1，3葡聚糖酶對百合疫霉菌細(xì)胞壁的消解也起到了重要作用。對于深綠木霉T2能否產(chǎn)生纖維素酶參與百合疫霉細(xì)胞壁的消解等問題本試驗尚未涉及還有待于進(jìn)一步研究。

試驗中還發(fā)現(xiàn)深綠木霉易揮發(fā)性與難揮發(fā)性代謝產(chǎn)物均能抑制百合疫霉病原菌的生長，多種拮抗作用方式并存對于深綠木霉抑制百合疫霉病原菌生長起到了關(guān)鍵作用，這與木霉菌株TR17既可產(chǎn)生非揮發(fā)性物質(zhì)又可產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)分別通過抑制孢子萌發(fā)和菌絲生長的作用方式影響煙草疫霉生長的研究結(jié)果相一致［11］。但究竟這兩種抗生物質(zhì)何種占主導(dǎo)地位、抗生物質(zhì)以何種作用方式起抑菌作用、抗生物質(zhì)定性分析以及其對動物與植物有無毒性等問題還有待于進(jìn)一步探討。

另外有研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基種類及培養(yǎng)基厚度均對木霉的生長和重寄生有重要影響，減少培養(yǎng)基中葡萄糖含量可以增強木霉的重寄生作用和抑菌效果。因此篩選適用的基質(zhì)對于制備深綠木霉生防制劑具有重要意義［12］。

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