劉穎坤，蔡莎藝，喻衛(wèi)武，冷華南，桂仁意

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 臨安 311300；2.浙江省湖州市林業(yè)局，浙江 湖州 313000）

毛竹Phyllostachys pubescens可以隔年連續(xù)采伐及永續(xù)利用，生長(zhǎng)速度快，經(jīng)濟(jì)用途非常廣泛，是當(dāng)?shù)剞r(nóng)民經(jīng)濟(jì)收入的重要來(lái)源［1］。鋁不是植物必需的營(yíng)養(yǎng)元素，微量的鋁（3～13 mg·L－1）可以刺激一些植物的生長(zhǎng)，質(zhì)量濃度偏高便會(huì)發(fā)生毒害作用［2］。鋁的毒害是酸性土壤限制作物產(chǎn)量的主要因子之一［3］。土壤中的鋁多數(shù)通常以硅酸鹽態(tài)或氧化態(tài)存在，對(duì)植物沒(méi)有毒害作用［4］。當(dāng)土壤的酸堿度低于pH 5.0時(shí)，鋁的可溶性狀態(tài)便會(huì)增強(qiáng)，形成 Al3+，Al（OH）2+和 Al（OH）2+等離子，對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用［5］?，F(xiàn)行的集約經(jīng)營(yíng)方式使得浙江省的毛竹林地酸堿度低至pH 4.8左右［6］，已有明顯導(dǎo)致土壤鋁活化的趨勢(shì)［7］。因此，對(duì)毛竹鋁脅迫方面的研究在當(dāng)前具有較強(qiáng)的實(shí)際意義。在植物根系分泌物中最常見(jiàn)的有機(jī)酸有：檸檬酸、草酸、琥珀酸、酒石酸、蘋(píng)果酸、乙酸和丙二酸等，它們的測(cè)定方法通常有高效液相色譜法［8］和毛細(xì)管電泳法［9］等。這類(lèi)物質(zhì)在植物中具有調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝的功效，能活化和固定植物根際潛在的養(yǎng)分［10］，并且植物根系在鋁脅迫下分泌有機(jī)酸被認(rèn)為是植物重要的耐鋁機(jī)制之一［11］。小麥Triticum aestivum，水稻Oryza sativa等植物的根系分泌有機(jī)酸的研究比較詳細(xì)［10，12－14］，但毛竹根系分泌物中有機(jī)酸方面的研究未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用水培法培養(yǎng)毛竹種子2～3周；用ACQUITYTMUltra Performance LC超高效液相色譜系統(tǒng)，以體積分?jǐn)?shù)為 3%的甲醇-磷酸二氫鉀（0.01 mol·L－1）（pH 2.6）溶液作流動(dòng)相，經(jīng) HSS T3 C18柱分離，選取前述植物根系分泌物中最常見(jiàn)的 4種有機(jī)酸為研究組分，考察流動(dòng)相的 pH值及分離溫度等因素對(duì)草酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋(píng)果酸4種有機(jī)酸分離效果的影響。本研究所建立的方法精密度、準(zhǔn)確度和再現(xiàn)性均符合痕量組分測(cè)定的要求，并且具有樣品用量少，分析速度快等特點(diǎn)，用于鋁脅迫時(shí)植物根系分泌物中有機(jī)酸的分析與研究，結(jié)果令人滿意。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、材料與試劑

ACQUITYTMUltra Performance LC超高效液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司），包含二元溶劑管理器、樣品管理器、柱溫箱和光電二陣管陣列檢測(cè)器，ACQUITY UPLC HSS T3 C18柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多）；Milli-Q超純水裝置；循環(huán)水式真空泵（中國(guó)河南鞏義市峪華儀器廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（中國(guó)上海亞榮生化儀器廠），人工氣候箱（中國(guó)寧波萊福科技有限公司），高壓滅菌鍋（日本三洋電器有限公司），酸度計(jì)，鑷子，培養(yǎng)皿等。

供試的毛竹種子于2006年采自廣西桂林市；采后存放于密封袋，于4℃冰箱中保存。草酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋(píng)果酸對(duì)照品（色譜純，中國(guó)上海君創(chuàng)生物科技有限公司），甲醇（色譜純，美國(guó)TEDIA公司），試驗(yàn)用水為超純水，氫氧化鈉，鹽酸等試劑均為分析純。

1.2 色譜條件

ACQUITY UPLC HSS T3 C18柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)為 3%的甲醇-磷酸二氫鉀（0.01 mol·L－1）（pH 2.6）流速為 0.15 mL·min－1的等度洗脫，分析時(shí)間為 6 min，柱溫為 30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為 210 nm，進(jìn)樣體積為 5.0 μL。

1.3 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液及試驗(yàn)中其他溶液的配制

精確稱量草酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋(píng)果酸對(duì)照品各11 mg，用超純水溶于5 mL容量瓶得質(zhì)量濃度2.2 g·L－1草酸溶液為作為對(duì)照品母液，然后稀釋10倍得0.22 g·L－14種有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣5.0，2.5，1.0，0.5，0.1 μL做4種有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

配制 0，100，500，1 000，2 000 μmol·L－1氯化鋁溶液（用氫氧化鈉溶液或鹽酸調(diào)酸堿度至 pH 4.5）；2.0 g·kg－1的高錳酸鉀，1 mol·L－1氫氧化鈉溶液，1 mol·L－1鹽酸，體積分?jǐn)?shù)為 75%乙醇水溶液等。

1.4 樣品的準(zhǔn)備和處理

①在2.0 g·kg－1的高錳酸鉀中消毒0.5 h，常溫下在溫水中浸泡24 h。②分別采用0，100，500，1 000，2 000 μmol·L－1等5種不同濃度氯化鋁溶液作為培養(yǎng)液，各濃度下采用5個(gè)培養(yǎng)皿（內(nèi)置濾紙2片·培養(yǎng)皿－1，并高溫滅菌），加培養(yǎng)液20 mL·培養(yǎng)皿－1，用鑷子（經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇消毒）分散放入30顆飽滿的種子。然后將培養(yǎng)皿放入人工氣候箱中（28℃左右，濕度80%左右）。③隔3 d更換1次培養(yǎng)液，培養(yǎng)2周，合并同一試驗(yàn)單元下5個(gè)培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至2 mL左右，用超純水定容至5 mL，過(guò)0.22 μm微孔濾膜后作為供試品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 為了考察檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)有機(jī)酸檢測(cè)靈敏度的影響，用光電二極管陣列檢測(cè)器在190～400 nm（紫外）下采集4種有機(jī)酸的紫外吸收光譜圖，4種有機(jī)酸均在210 nm附近有較大的吸收，重復(fù)性好，不易受流動(dòng)相中其他物質(zhì)的干擾，故以下實(shí)驗(yàn)均采用210 nm波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)。

2.1.2 色譜柱的選擇 本實(shí)驗(yàn)所用的色譜柱在美國(guó)Waters公司的BEH C18色譜柱、BEH Shield C18色柱、HSS T3 C18色譜柱，小分子有機(jī)酸極性比較大，多數(shù)做小分子有機(jī)酸的文獻(xiàn)都是用純水相作為流動(dòng)相。前2種UPLC柱都不可以用純水相洗脫，且無(wú)法將4種有機(jī)酸分離。因此，我們選擇專門(mén)用于做極性較大的成分，可以用純水相洗脫的HSS T3 C18色譜柱。

2.1.3 流動(dòng)相的選擇 有機(jī)酸為弱酸，在水系流動(dòng)相易解離，故采用抑制電離的方法，使它們變?yōu)榉肿討B(tài)的酸在柱子上保留而得到分離。本實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相在硫酸、甲酸、磷酸二氫鉀之間選擇。硫酸是強(qiáng)酸，不適合作流動(dòng)相的改性劑；用2.0 g·kg－1的甲酸作為流動(dòng)相時(shí)，基線漂移，且在目標(biāo)峰附近出現(xiàn)倒峰。磷酸鹽緩沖溶液作為一種弱酸電離抑制劑在紫外區(qū)幾乎無(wú)吸收，用其作為測(cè)定有機(jī)酸的流動(dòng)相有利于有機(jī)酸的分離而不影響檢測(cè)。由于較高濃度的鹽緩沖溶液對(duì)泵和柱子都有影響，而較低濃度的鹽緩沖溶液又對(duì)分離有影響，故選擇0.01 mol·L－1的磷酸二氫鉀緩沖溶液作流動(dòng)相的主要成分。

2.1.4 流動(dòng)相 pH值的選擇 以不同pH值（用磷酸調(diào)節(jié)）的0.01 mol·L－1的磷酸二氫鉀溶液作流動(dòng)相，測(cè)定各有機(jī)酸的保留時(shí)間。結(jié)果顯示，流動(dòng)相pH值對(duì)有機(jī)酸的分離影響很大。當(dāng)pH 2.0時(shí)，琥珀酸和檸檬酸不能完全分離；逐步提高pH值，4種有機(jī)酸逐漸得到分離，但草酸和酒石酸、蘋(píng)果酸的分離度卻逐漸減??；當(dāng)pH＞3.0時(shí)，檸草酸和酒石酸不能有效分離；當(dāng)pH 3.2時(shí)，部分有機(jī)酸的出峰順序發(fā)生變化。由于pH＜2.5的溶液會(huì)影響色譜柱的壽命，經(jīng)綜合考慮，最后選擇pH 2.6磷酸鹽緩沖溶液。

2.1.5 流動(dòng)相中甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的選擇 在流動(dòng)相中加入少量甲醇，能有效地改善峰形。以0.01 mol·L－1的 K2HPO4（pH 2.6）溶液作流動(dòng)相，對(duì)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的甲醇（0，10 ，20，30，40，50 g·kg－1）對(duì)色譜分離的影響進(jìn)行了比較。結(jié)果表明：隨著流動(dòng)相中甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，有機(jī)酸的疏水端基與固定相的相互作用減弱，保留時(shí)間變短，30 g·kg－1的甲醇-緩沖溶液分離度和峰形較好。

2.1.6 其他條件選擇 以體積分?jǐn)?shù)為3%的甲醇-磷酸二氫鉀（pH 2.6）溶液作流動(dòng)相比較了流速、柱溫對(duì)保留時(shí)間的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：流速0.2 mL·min－1時(shí)，分離度降低，草酸和酒石酸不能有效分離,流速0.1 mL·min－1時(shí)，由于流速太小，當(dāng)進(jìn)樣量較大時(shí)，影響分離效果；而柱溫增高則會(huì)加快傳質(zhì)過(guò)程，縮小分離度。因此，選擇在0.15 mL·min－1流速下及室溫（30℃）進(jìn)行測(cè)定。

2.2 超高效液相色譜分析

用HSS T3 C18柱，體積分?jǐn)?shù)為3%的甲醇-磷酸二氫鉀（pH 2.6）緩沖溶液作為混合流動(dòng)相，分析物可以在6 min內(nèi)得到很好的分離。草酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸、琥珀酸的保留時(shí)間分別為：1.507±0.089，2.310±0.078，3.900±0.46，5.243±0.065 min，標(biāo)品的色譜圖如圖1所示。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度及回收率

取500 μmol·L－1氯化鋁的培養(yǎng)液4份，其中1份作本底（樣品色譜圖見(jiàn)圖1），另3份各添加不同量的有機(jī)酸標(biāo)品溶液按1.4（3）中的處理樣品方法處理后測(cè)定各成分，平行測(cè)定5次·樣品－1，考察方法的回收率和精密度。根據(jù)3.3中所述的方法將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，以峰面積（mV·s）積分值為縱坐標(biāo)，標(biāo)品溶液的濃度（μg）為橫坐標(biāo)，求得線性回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表1。4種分析物的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于2%；回收率均為95%～105%，表明該分析方法有很好的精密度和準(zhǔn)確度。

2.4 樣品的測(cè)定

樣品預(yù)處理后，按照已優(yōu)化的色譜方法注入超高效液相色譜儀中，根據(jù)分析物的保留時(shí)間及光譜圖對(duì)樣品中的色譜峰進(jìn)行定性，水培毛竹根系分泌物中可以檢出的有機(jī)酸為草酸和蘋(píng)果酸，另外2種有機(jī)酸未檢出。樣品色譜圖見(jiàn)圖2。結(jié)果表明：本方法測(cè)定不同濃度鋁處理的毛竹根系分泌物中的草酸和蘋(píng)果酸含量，結(jié)果如表2所示。

表1 有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 1 Calibration curve of organic acids

圖1 4種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Figure 1 Liquid chromatogram of standard of 4 organic acids

圖2 500 μmol·L－1氯化鋁處理毛竹培養(yǎng)液中有機(jī)酸色譜圖Figure 2 Liquid chromatogram of organic acids in culture solution containing 500 μmol·L－1AlCl3

表2 不同濃度氯化鋁處理毛竹分根系泌出有機(jī)酸的量Table 2 Content of organic acids of culture solution containing different concentrations of AlCl3

3 結(jié)論

采用超高效液相色譜法測(cè)定毛竹根系分泌物中的痕量有機(jī)酸，樣品制備簡(jiǎn)便，分離效果好，方法的線性范圍及分析結(jié)果的精密度、準(zhǔn)確度和回收率都能滿足毛竹根系分泌物中痕量有機(jī)酸定性和定量分析的要求，并且具有樣品用量少，分析快速等特點(diǎn)，為植物根系分泌物中痕量有機(jī)酸的研究，以及植物根際環(huán)境中有機(jī)酸作用機(jī)理的探尋提供了重要的實(shí)驗(yàn)手段。結(jié)果表明：毛竹根系分泌的有機(jī)酸只有草酸和蘋(píng)果酸，并且草酸和蘋(píng)果酸的含量與鋁離子的濃度有一定的相關(guān)性，鋁離子的存在對(duì)毛竹根系有機(jī)酸的分泌有促進(jìn)作用。特別是當(dāng)氯化鋁濃度在 500 μmol·L－1時(shí)，促進(jìn)作用最明顯，在 1 000～ 2 000 μmol·L－1時(shí)，促進(jìn)作用相對(duì)減弱。

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