韓英，徐文清，楊福軍，沈秀，洪閣，黃潔，周則衛(wèi)

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，天津市分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300192)

銀耳(Tremella fuciformis Berk)又稱白木耳，為常用保健品，其主要化學(xué)成分為銀耳多糖［1-2］。大量實(shí)驗(yàn)研究表明，銀耳多糖具有抗輻射［3］、抗氧化［4］、增強(qiáng)免疫力［5］、升高白細(xì)胞、降血糖以及抗腫瘤等作用［6］。研究表明，藥物抗腫瘤作用的機(jī)制與增強(qiáng)免疫和誘導(dǎo)凋亡等有關(guān)［7］。為了進(jìn)一步開發(fā)銀耳多糖的藥用價(jià)值，研究其抗腫瘤作用的機(jī)制，筆者從銀耳孢子發(fā)醇粉中提取、分離得到了一種均一體銀耳孢子多糖，觀察其對小鼠H22肝癌的抑制作用，用基因芯片技術(shù)初步探討銀耳多糖抑制肝癌的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 銀耳多糖(相對分子質(zhì)量為68 000，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所藥物室從銀耳孢子發(fā)酵粉中提取、分離得到的均一體多糖)，香菇多糖(福州梅峰制藥廠，批號:041201)，氟尿嘧啶(南通海爾斯藥業(yè)有限公司，批號:20040301)，順鉑(云南生物谷燈盞花藥業(yè)有限公司，批號:20040701)，H22肝癌細(xì)胞株(天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所)。昆明種小鼠，體質(zhì)量18～22 g，雌雄兼用，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物室，許可證號:SCXK-(軍)2002-001。芯片類型:BiostarM-40s，上海聯(lián)合基因科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 荷H22肝癌小鼠模型的建立 100只實(shí)驗(yàn)小鼠，每只左腋窩皮下接種瘤細(xì)胞懸液0.2 mL，活細(xì)胞數(shù)為1×106。

1.2.2 分組與給藥 接種后隨機(jī)分為藥物組和對照組，藥物組分高、中、低3個劑量組，于接種后第2天分別腹腔注射銀耳多糖12，6和1 mg·kg-1，間隔2 d給藥1次，共給藥3次，陽性藥(順鉑、香菇多糖)采用相同給藥方式，對照組只給予0.9%氯化鈉溶液。為了比較給藥方式對腫瘤的抑制作用，設(shè)銀耳多糖連續(xù)給藥組(給藥10次)。基因芯片實(shí)驗(yàn)用腫瘤組織，每組選取6 mg·kg-1作為樣本。

1.2.3 療效評價(jià) 停藥24 h處死小鼠，稱定體質(zhì)量，解剖，剝離瘤塊，稱瘤質(zhì)量。腫瘤抑制率=(對照組平均瘤質(zhì)量-給藥組平均瘤質(zhì)量)/對照組平均瘤重×100%?；蛐酒瑢?shí)驗(yàn)用腫瘤組織放置在液氮罐中保存。

1.2.4 總RNA的提取及純化 取凍存的實(shí)驗(yàn)組(15只)和對照組(15只)腫瘤組織，按組別用組織勻漿機(jī)分別混勻，用UNIzol試劑抽提腫瘤組織的總RNA，紫外分析及電泳檢測。用OligotexmRNA Midi試劑盒純化mRNA。

1.2.5 探針標(biāo)記 逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記cDNA探針并純化。用Cy5-dUTP和Cy3-dUTP標(biāo)記實(shí)驗(yàn)組和對照組腫瘤組織的mRNA，經(jīng)乙醇沉淀后溶解在雜交液中。

1.2.6 芯片雜交與熒光掃描 將基因芯片和雜交探針置于95℃水浴中變性2 min;將探針置于芯片上，用蓋玻片覆蓋，置于雜交艙中，用Parafilm密封，放入42℃雜交箱內(nèi)雜交過夜(16～18 h)。然后去除蓋玻片，洗滌、晾干。用Scan Array 4000掃描儀掃描芯片，Gene Pix Pro 3.0圖像處理軟件分析Cy3和Cy5兩種熒光信號的強(qiáng)度和比值，基因差異表達(dá)標(biāo)準(zhǔn):Cy5和Cy3的比值＜0.5為表達(dá)下調(diào)，0.5～2.0表示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，＞2.0表達(dá)上調(diào)。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行，多組間比較用One-Way ANOVA檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 銀耳多糖抑制小鼠H22肝癌實(shí)驗(yàn) 順鉑對小鼠H22肝癌具有明顯的抑制作用。香菇多糖和銀耳多糖對H22肝癌均具有一定的抑制作用，與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。但順鉑影響小鼠的生長，使其體質(zhì)量減輕。相反，香菇多糖和銀耳多糖可促進(jìn)小鼠體質(zhì)量增加，與對照組比較，體質(zhì)量增加明顯。見表1。銀耳多糖對荷H22肝癌小鼠肝、脾、胸腺指數(shù)的影響見表2。結(jié)果表明，順鉑可明顯傷及小鼠的肝、脾、胸腺等器官，使其萎縮。相反，香菇多糖和銀耳多糖可促使小鼠肝、脾、胸腺等器官有一定程度的增長。因?yàn)槠?、胸腺為免疫器官，因此可見，香菇多糖和銀耳多糖可促進(jìn)小鼠免疫功能的增強(qiáng)。

2.2 總RNA電泳分析 抽提出的樣品和對照的總RNA通過電泳，進(jìn)行純度分析。結(jié)果如圖1。結(jié)果表明，RNA樣本的A260/A280的比值為1.9～2.0，總RNA電泳圖譜有清晰的28S，18S條帶證明抽提得到高純化的總RNA，可以用于基因芯片研究。

2.3 芯片檢測結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)Scan Array 4000掃描儀掃描，用BiostarM-40s圖像處理軟件:Gene Pix Pro 3.0處理掃描結(jié)果，用Cy5/Cy3信號比值判定結(jié)果。結(jié)果見圖2。圖中，X軸、Y軸分別以Cy3和Cy5熒光強(qiáng)度值(前景值-背景值)和熒度值為坐標(biāo)，每一個數(shù)據(jù)點(diǎn)代表芯片上一個基因點(diǎn)的雜交信號;數(shù)據(jù)點(diǎn)若為紅色，則代表Y值與X值的比值在0.5～2.0，基本屬非差異表達(dá);數(shù)據(jù)點(diǎn)若為黃色，則代表Y值與X值的比值＜0.5或＞2.0，該點(diǎn)很可能屬于表達(dá)差異。分析結(jié)果表明，共有324數(shù)據(jù)點(diǎn)為黃色，表明有324個基因有表達(dá)差異。其中表達(dá)上調(diào)基因185個，表達(dá)下調(diào)基因139個。因?yàn)椴町惐磉_(dá)基因數(shù)量太多，不再具體列出基因編號和強(qiáng)度比值。

3 討論

在抑制H22肝癌實(shí)驗(yàn)中，連續(xù)給藥組抑制腫瘤效果不如間隔給藥組，原因可能是銀耳多糖作為免疫調(diào)節(jié)劑發(fā)揮抗腫瘤作用，連續(xù)給藥會造成免疫麻痹，從而使抑瘤效果降低。

表1 7組小鼠H22肝癌抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab．1 The inhibition effect of H22 hepatoma ofm ice in seven groups ±s

表1 7組小鼠H22肝癌抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab．1 The inhibition effect of H22 hepatoma ofm ice in seven groups ±s

與對照組比較，*1 P＜0.01，*2 P＜0.05Compared with control group，*1 P ＜0.01，*2 P ＜0.05

組別 劑量/(mg·kg-1)小鼠/只給藥次數(shù)/次體質(zhì)量增長 瘤質(zhì)量g抑瘤率/%銀耳多糖低劑量組 1 10 3 6.82±2.33*1 1.66±1.09*1 59.0中劑量組 6 10 3 7.20±1.52*1 1.12±0.76*1 72.3高劑量組 12 10 3 6.27±1.93*2 1.77±1.04*1 56.3連續(xù)給藥組 12 10 10 5.51±3.04 2.18±1.41*1 46.2香菇多糖組 1 10 3 7.93±2.55*1 1.50±1.17*1 63.0順鉑組 5.3 10 3 -4.49±1.75*1 0.93±0.15*1 90.4對照組 … 10 … 3.20±3.18 4.05±1.27…

表2 7組荷瘤小鼠肝、脾、胸腺指數(shù)比較Tab．2 The comparisons of liver，spleen and thymus index of tunor-bearingm ice in seven groups mg·g-1，±s

表2 7組荷瘤小鼠肝、脾、胸腺指數(shù)比較Tab．2 The comparisons of liver，spleen and thymus index of tunor-bearingm ice in seven groups mg·g-1，±s

與對照組比較，*1 P＜0.05，*2 P＜0.01Compared with control group，*1 P ＜0.05，*2 P ＜0.01

組別 劑量/(mg·kg-1)小鼠/只給藥次數(shù)/次肝指數(shù) 脾指數(shù) 胸腺指數(shù)銀耳多糖低劑量組 1 10 3 25.2±4.0 15.74±3.62 4.08±0.99*1中劑量組 6 10 3 24.3±4.7 14.89±3.41 4.55±0.97高劑量組 12 10 3 22.5±3.4 16.06±4.08 4.84±1.11*1連續(xù)給藥組 12 10 10 23.3±2.6 17.31±2.88 4.44±1.48香菇多糖組 1 10 3 24.7±2.8 16.32±3.17 3.04±0.58順鉑組 5.3 10 3 9.8±1.9*2 3.36±1.34*2 1.65±0.54*2對照組 … 10 …22.7±6.3 13.44±4.60 3.61±0.91

不同組織樣本(對照組/實(shí)驗(yàn)組)雜交信號強(qiáng)度散點(diǎn)圖，只是一個示意圖，表明在基因芯片上表達(dá)差異基因與非差異表達(dá)基因的數(shù)量，具體基因的變化在圖1中表現(xiàn)不出來。通過追蹤文獻(xiàn)以及與功能基因芯片信息的比對分析，可以將這些表達(dá)差異基因分為以下幾個方面。①信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因，如:鈣信號分子基因，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白基因，JAK-STAT通路基因，應(yīng)激/熱休克通路基因等。②干細(xì)胞和分化細(xì)胞的分子標(biāo)志基因，如:GOLLI-MBP/HMBPR， LC1/MAP5， Tubb3， Actc1，GREMLIN2/PRDC。③細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子基因，如:DISM2/PPP1C，GABPA。④細(xì)胞基質(zhì)和細(xì)胞粘連相關(guān)基因，如:COL3A-1/MMS10-W，DC/DSPG2。⑤轉(zhuǎn)運(yùn)和泵基因，如:SUR2/SUR2A，ANT2，ATP5B。⑥乳腺癌直接相關(guān)基因，如:RAC2，24P3/NGAL。⑦p53上游信號/p53調(diào)節(jié)劑基因，p53信號通路基因，如:CSNK1A，BETA/REV-ERB。⑧DNA損傷檢測/p53和ATM通路基因，如:TI-225，ABL/C-ABL。⑨抗原遞呈基因，如:CD1A/CD1D。⑩化療應(yīng)答相關(guān)基因，如:9630030H21?！?1 G1 期基因，如:Rbl2，CRK3。

在用基因表達(dá)芯片研究銀耳多糖抑制腫瘤作用的機(jī)制中，發(fā)現(xiàn)324個表達(dá)差異基因，在這些表達(dá)差異的上調(diào)/下調(diào)基因中，許多是與銀耳多糖增強(qiáng)免疫和抗腫瘤作用相一致的。如抗原呈遞基因(如CD1A/CD1D)表達(dá)上調(diào)，可以增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對腫瘤的殺傷作用。化療應(yīng)答相關(guān)基因(如9630030H21)表達(dá)上調(diào)，可以增強(qiáng)腫瘤組織對化療藥物的敏感性，提高化療藥物對腫瘤殺傷作用。DNA損傷檢測/p53和ATM通路基因(如TI-225、ABL/C-ABL)和G1期基因(如Rbl2、CRK3)均表達(dá)上調(diào)，具有異曲同工的作用。p53蛋白在細(xì)胞生長調(diào)節(jié)中具有重要作用，特別是在G1期調(diào)控點(diǎn)中的調(diào)節(jié)作用，它能抑制細(xì)胞生長，使被抑制細(xì)胞停留在G1期。研究表明，p53阻抑細(xì)胞于G1期，可能與影響相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄和DNA修復(fù)事件有關(guān)［8］。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)存在DNA損傷時，有兩個檢查點(diǎn)控制細(xì)胞周期進(jìn)程。其中，G1/S期及S期的檢查點(diǎn)阻止損傷了的DNA進(jìn)入S期進(jìn)行復(fù)制，這樣就避免新合成的DNA將損傷固定下來，防止損傷的DNA進(jìn)行復(fù)制。終止DNA復(fù)制，細(xì)胞被停滯在G1期，這樣就能夠有足夠的時間使損傷的DNA得以完成修復(fù)，從而避免錯誤信息的轉(zhuǎn)錄，控制基因突變過程，保證遺傳性能的穩(wěn)定性。如果DNA損傷不能得到有效修復(fù)，則p53也可誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡［9］。

銀耳多糖體內(nèi)抑制腫瘤作用也是其進(jìn)入體液后，作用于體內(nèi)一系列的調(diào)控系統(tǒng)，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)揮其腫瘤抑制效應(yīng)的結(jié)果。表達(dá)譜基因芯片是用于基因組功能研究的一種應(yīng)用型芯片，在功能基因組學(xué)研究中發(fā)揮廣泛的作用［10］。本研究采用基因芯片分析手段，具有高通量和快速等優(yōu)點(diǎn)。篩選得到了大量與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和理化治療相關(guān)的差異表達(dá)基因。通過對這些差異基因的進(jìn)一步研究，有希望找到銀耳多糖治療腫瘤的新的藥物作用靶點(diǎn)，同時，還可以發(fā)現(xiàn)銀耳多糖其他作用靶點(diǎn)，拓展其臨床應(yīng)用范圍，以期發(fā)揮更大的經(jīng)濟(jì)和社會效益。

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