何志國(綜述)，趙永忠(審校)

(桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，廣西桂林541001)

肝纖維化是指肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織異常增生，是一種“創(chuàng)傷愈合”的慢性漸進性的病理過程。肝細胞損傷后，炎性反應(yīng)致白細胞聚集于炎癥病灶，釋放多種炎性細胞因子，如轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)、血小板衍生生長因子等，這些炎性細胞因子再激活肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSC)轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，釋放大量的細胞外基質(zhì)，包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原蛋白，這就導致了一個不可逆轉(zhuǎn)的膠原沉積，進而導致肝纖維化［1，2］。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是細胞表面信號轉(zhuǎn)導跨膜受體，在肝纖維化的發(fā)生及發(fā)展機制中具有重要作用［3］。TLRs在肝臟的庫普弗細胞、內(nèi)皮細胞、樹突狀細胞、膽管上皮細胞、HSC以及肝細胞等多種細胞上表達。研究表明，在肝免疫細胞和HSC上被激活的TLRs在肝纖維化形成過程中具有重要的作用［4］。

1 TLRs家族

1．1 TLRs及其配體 TLRs家族為固有免疫系統(tǒng)中的保守性膜受體，負責識別多種外源性和內(nèi)源性配體分子［5］。自1997年Medzhitov等鑒別并克隆出人的一種果蠅Toll同源受體以來，已有13種TLRs在哺乳動物中被確定，人有10種，大鼠有12種［6］。其中 TLR1、2、4、5、6 和 10 表達于細胞表面，活化后遷移至吞噬溶酶體;TLR3、7、8、9表達于細胞內(nèi)，主要位于細胞內(nèi)和胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。TLR是具有類似結(jié)構(gòu)的Ⅰ型跨膜形式識別受體，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞質(zhì)區(qū)三部分組成。胞外區(qū)富含亮氨酸重復(fù)序列，為550～980個氨基酸組成;跨膜區(qū)為半胱氨酸;胞質(zhì)區(qū)存在一段序列保守區(qū)，該序列與白細胞介素(interleukin，IL)1受體同源，由約200個氨基酸組成。雖然TLR家族具有相似的結(jié)構(gòu)，但不同的TLR能夠識別不同的配體。病原相關(guān)的TLR配體可分為 三 類:與 TLR2/TLR1、TLR2/TLR6、TLR4 結(jié)合的脂質(zhì)與脂質(zhì)蛋白;與TLR5結(jié)合的蛋白質(zhì);與TLR3、7、8、9 結(jié)合的核酸［7］。

1．2 TLRs表達及調(diào)控 TLRs活化一方面對微生物迅速作出反應(yīng)，同時觸發(fā)適應(yīng)性免疫應(yīng)答;另一方面也會因過量的細胞因子及抗原遞呈細胞的過度活化而導致疾病。有研究表明，機體可通過誘導負性調(diào)節(jié)機制特異性干擾TLRs信號轉(zhuǎn)導途徑對TRLs表達進行調(diào)節(jié)，使機體避免免疫系統(tǒng)過度激活而導致?lián)p害［8］。其中包括:①誘導產(chǎn)生可溶性TLRs封閉膜表面TLRs與配體的結(jié)合。②細胞內(nèi)負性調(diào)節(jié)因子(如接頭蛋白髓樣細胞分化因子)和跨膜蛋白調(diào)節(jié)因子通過滅活TLRs信號轉(zhuǎn)導途徑中的適配分子和酶封閉TLRs活化途徑。③泛素化誘導分子，如TLRAD3促進的TLR降解。④TGF-β直接下調(diào)TLRs表達。⑤TLRs誘導的凋亡阻止過度炎性反應(yīng)等影響TLRs表達及功能［8］。

2 TLRs在肝纖維化中的作用

2．1 TLRs與HSC HSC位于肝竇Disse間隙內(nèi)，胞體呈卵圓形，形狀不規(guī)則，有數(shù)個星狀突起。正常情況下其主要功能是儲存和代謝維生素A。形態(tài)學上可見胞質(zhì)內(nèi)數(shù)個富含維生素A和三酰甘油的脂滴。此外，HSC還分泌少量的細胞外基質(zhì)和一定量的基質(zhì)金屬蛋白酶。在肝損傷過程中HSC發(fā)生表型轉(zhuǎn)化而激活成為肌成纖維細胞，產(chǎn)生大量細胞外基質(zhì)促進肝纖維化的形成。業(yè)已證實，HSC激活是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)。Paik等［9］發(fā)現(xiàn)活化的HSC表達TLR4和其輔助受體髓樣分化蛋白2和CD14。脂多糖可直接激活HSC，在激活的 HSC中存在完整的TLR4信號通路，脂多糖直接激活HSC表面的TLR4進而激活核因子 κB(nuclear factor-kappaB，NF-κB)和c-Jun氨基末端激酶通路，誘導炎性細胞因子和黏附分子的表達。脂多糖同時還增強細胞間黏附分子1和血管細胞黏附分子1在細胞表面的表達，并誘導活化的HSC分泌趨化因子IL-8和單核趨化蛋白1。如果抑制NF-κB的活性，同時部分抑制c-Jun氨基末端激酶的活性，可以完全阻斷HSC分泌IL-8，這表明NF-κB和c-Jun氨基末端激酶在HSC的TLRs信號表達中起關(guān)鍵作用。資料顯示，TLR4可上調(diào)各類趨化因子(單核趨化蛋白1、巨噬細胞炎癥蛋白1α、庫普弗細胞、巨噬細胞炎癥蛋白1β、調(diào)節(jié)正常T細胞表達和分泌因子、巨噬細胞炎癥蛋白2、干擾素誘導蛋白10)和TLR2的表達，而通過接頭蛋白髓樣細胞分化因子途徑和NF-κB途徑下調(diào)靜止的HSC的TGF-β仿真受體 Bambi(BMP and the activin memebrane-bound inhibitor)來增加TGF-β介導的HSC活化及其膠原的產(chǎn)生［10］。TLR3和TLR4的配體可通過巨噬細胞轉(zhuǎn)接蛋白刺激 HSC 產(chǎn)生 TGF-β［11］，但 TLR3的配體可直接刺激HSC產(chǎn)生TGF-β，而TRL4的配體則無此功能，這提示HSC有不同于巨噬細胞的獨特通路即 TLR3/TLR4-TRIF［12］。

TLR9在HSC上也有表達。Watanabe等［13］已經(jīng)證實，來源于肝細胞凋亡的DNA分子通過TLR9信號通路誘導HSC的分化，隨著HSC內(nèi)的表達，TGF-β和Ⅰ型膠原纖維的mRNA水平升高，來源于肝細胞凋亡的DNA刺激HSC發(fā)生纖維化反應(yīng)。

2．2 TLR4與肝纖維化 TLR4加強HSC和庫普弗細胞間的相互作用，加強由TGF-β或者庫普弗細胞誘導的HSC的活化，從而促進肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。TRL4突變小鼠比接受膽管結(jié)扎、長期予四氯化碳(CCl4)，或硫代乙酰胺處理的TRL4野生型小鼠更少發(fā)生肝臟炎癥和纖維化［10］。缺乏CD14和脂多糖結(jié)合蛋白的小鼠也顯示膽汁性肝纖維化發(fā)生率降低［14］。乙醇喂養(yǎng)的小鼠血漿內(nèi)毒素水平顯著增加，可導致肝臟脂肪沉積、壞死和炎癥，肝臟受到損傷后，脂多糖水平在肝門脈系統(tǒng)和體循環(huán)系統(tǒng)也有明顯的增加［15］。在內(nèi)毒素作用下，一方面肝臟活化的巨噬細胞數(shù)量明顯增加，伴隨氮氧化物合成酶2、環(huán)氧化酶2、微粒體前列腺素E合成酶1、IL-1和腫瘤壞死因子α基因的表達;另一方面內(nèi)皮細胞也發(fā)生相同變化，產(chǎn)生細胞因子損害肝細胞。無論是巨噬細胞，還是內(nèi)皮細胞都通過TLR4信號轉(zhuǎn)導作用最終導致轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白1和NF-κB轉(zhuǎn)錄基因活化［16］。這些結(jié)論提示脂多糖與TLR4間的相互作用對肝纖維化的進展具有重要作用。TLR4也可被內(nèi)源性配體激活，如高遷移率族蛋白B1、透明質(zhì)酸、熱休克蛋白60等［7，15］。但目前沒有強有力的證據(jù)表明內(nèi)源性TLR4配體與肝纖維化有相關(guān)性，還有待進一步研究。

業(yè)已證實，庫普弗細胞是TLR4配體脂多糖的靶點，并產(chǎn)生各種炎性及纖維化細胞因子，這些細胞因子可激活 HSC［17］。靜止和激活的 HSC都表達TLR4［9，10］。庫普弗細胞和 HSC 的 TLR4 在肝纖維化中的具體作用尚不清楚。但有研究顯示，膽總管結(jié)扎后，TLR4野生型肝臟細胞的小鼠出現(xiàn)明顯的肝纖維化，而TLR4突變型肝臟細胞的小鼠表現(xiàn)出肝纖維化顯著降低［10］。

2．3 TRL4和TGF-β在HSC的活化中的相互作用

TGF-β是強有力的纖維源性細胞因子。TGF-β可通過以下途徑促使肝纖維化的發(fā)生:①激活肝內(nèi)HSC，誘導膠原和其他細胞外基質(zhì)蛋白的產(chǎn)生;②抑制基質(zhì)降解蛋白水解酶的合成，促進肝內(nèi)膠原沉積;③調(diào)節(jié)HSC儲存維生素A的能力，進而調(diào)節(jié)基質(zhì)產(chǎn)生;④抑制肝細胞內(nèi)DNA合成，并可作為調(diào)節(jié)信號阻止肝細胞再生。目前的研究顯示，HSC上的TLR4至少有兩種作用:①刺激HSC產(chǎn)生各種趨化因子和黏附分子(細胞間黏附分子1、血管細胞黏附分子1、E選擇素)，使庫普弗細胞和(或)循環(huán)巨噬細胞聚集到HSC所在部位，事實上，含脂多糖的HSC條件培養(yǎng)基可增加庫普弗細胞遷移和黏附［10］。②TLR4的活化會增強HSCs TGF-β信號表達。在膠原蛋白啟動子驅(qū)動的綠色熒光蛋白(coll-GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠分離的HSC中，綠色熒光強度會隨膠原啟動子活性增加而增強［18］。單獨用 TGF-β處理僅能使靜止的HSC膠原蛋白啟動子活性輕度升高，而用脂多糖預(yù)處理可使TGF-β誘導的HSC膠原啟動子活性進一步增強。這些結(jié)果表明，TLR4的信號增強了HSC的TGF-β信號［10］，而在庫普弗細胞上的TLR4對TLR-4介導的HSC的活化作用并不大，但庫普弗細胞作為TGF-β的重要來源是 HSC激活所必需的，因為TGF-β抑制劑處理的庫普弗細胞和HSC共培養(yǎng)，HSC活化完全停滯。綜上所述，在肝纖維化形成過程中，TLR4信號轉(zhuǎn)導對HSC的激活起著關(guān)鍵作用。

2．4 TRL3與肝纖維化 TRL3識別雙鏈RNA，如多聚肌醇:胞嘧啶核苷酸(Ploy I:C)，誘導產(chǎn)生干擾素-Ⅰ和干擾素-Ⅱ，在由CCl4誘導的肝纖維化模型中，給予TLR3的配體Ploy I:C治療可抑制肝纖維化的發(fā)生［19］。Ploy I:C抑制肝纖維化的發(fā)生是通過自然殺傷細胞和干擾素γ起作用的。自然殺傷細胞在Ploy I:C的刺激下對有活性的HSC產(chǎn)生細胞毒作用，而對靜止的HSC無反應(yīng)。Ploy I:C直接或間接通過干擾素γ增強腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體在自然殺傷細胞上的表達，增加自然殺傷細胞對活性HSC的細胞毒作用，抑制肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展。進一步研究證實，依賴Ploy I:C抑制肝纖維化發(fā)生的自然殺傷細胞在接受乙醇處理的動物中是被抑制的［20］。這些結(jié)果表明，依賴TLR3介導的自然殺傷細胞導致HSC的死亡減少，是酒精性肝病發(fā)生肝纖維化的潛在機制之一。

2．5 TLR9與肝纖維化 TLR9可識別細菌的非甲基化CpG-DNA［11］。研究證實，肝纖維化的進展與腸道菌群的移位及其產(chǎn)物有關(guān)［10］。資料顯示，肝硬化患者和肝硬化大鼠的血漿及腹水中的細菌DNA水平均升高［21］。Watanabe 等［13］指出，在肝纖維化過程中，壞死肝細胞變性的DNA與TLR9結(jié)合后可刺激HSCs使肝纖維化加重，而經(jīng)膽總管結(jié)扎和CCl4慢性處理的TLR9基因缺陷大鼠肝纖維化程度則減輕［13，22］，提示細菌 DNA 和來源于機體凋亡細胞的DNA均可作為TLR9的配體，參與肝纖維化的進展。Connolly等［23］已經(jīng)發(fā)現(xiàn)表達 TLR9和 CD11c細胞在肝纖維化過程中發(fā)揮重要作用。CD11c在樹突狀細胞、單核細胞和巨噬細胞上表達［24］。耗竭CD11c后的大鼠肝纖維化的發(fā)生率明顯降低，提示表達CD11c的非實質(zhì)肝細胞在肝纖維化發(fā)生過程中具有重要作用［23］。肝纖維化時 CD11c細胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子α、IL-6和各種趨化因子的能力增強，在TLR9配體的作用下，這些因子反過來又刺激CD11c細胞進一步表達，但以上現(xiàn)象不存在于正常肝組織中。CpGDNA介導肝纖維化中CD11c陽性細胞的增加，自然殺傷細胞的細胞毒性和細胞因子的產(chǎn)生，包括依賴腫瘤壞死因子α途徑干擾素γ的增加。CpG-DNA介導CD11c陽性細胞誘導HSC增殖和炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，如IL-1α、IL-6、單核趨化蛋白1。這項研究顯示，TLR9和CD11c陽性細胞在肝纖維化中有重要作用。然而，關(guān)于樹突狀細胞在肝纖維化中的作用還未完全清楚，需要更進一步的研究來闡明。

3 結(jié)語

目前認為，肝纖維化的發(fā)生是繼發(fā)于肝臟炎癥或細胞損傷后的修復(fù)反應(yīng)，幾乎所有的慢性肝臟損害的患者均可發(fā)生。近年來，TLRs在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。但目前仍有許多問題需要解決，雖然內(nèi)毒素血癥可促進肝纖維化發(fā)生、發(fā)展已日漸明確，但內(nèi)毒素如何通過信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)導致此效應(yīng)機制仍不清楚。盡管其中的詳盡機制并未完全明了，但對其分子機制的進一步研究無疑將為臨床上肝纖維化的防治提供新的策略。

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