蔣繼志，王興哲，王會(huì)仙

（1.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002；2.河北大學(xué) 圖書館，河北 保定 071002）

2種致病疫霉拮抗真菌混合發(fā)酵及抗菌物質(zhì)穩(wěn)定性研究

蔣繼志1，王興哲1，王會(huì)仙2

（1.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002；2.河北大學(xué) 圖書館，河北 保定 071002）

為獲得防治馬鈴薯晚疫病穩(wěn)定的生防制劑，對能夠有效抑制致病疫霉的拮抗菌梨黑斑病菌LH-03和白菜黑斑病菌BH-09混合發(fā)酵的可行性及發(fā)酵條件進(jìn)行了確定和優(yōu)化，同時(shí)對混合發(fā)酵產(chǎn)物的抗菌穩(wěn)定性進(jìn)行了初步研究.結(jié)果表明，2種真菌之間無拮抗作用，可進(jìn)行混合發(fā)酵，并且發(fā)現(xiàn)混合發(fā)酵后可有效提高2種真菌發(fā)酵液的抑菌活性；混合發(fā)酵的最佳發(fā)酵條件為pH 6.29，25℃、黑暗、靜置、培養(yǎng)4d，在此條件下所得發(fā)酵產(chǎn)物對致病疫霉的抑菌率可達(dá)92.15%，顯著高于2種拮抗菌單獨(dú)發(fā)酵液的抑菌效果.混合發(fā)酵液經(jīng)不同溫度及不同pH值處理后，其抑菌活性基本保持不變或略有下降，其中在121℃高溫處理下抑菌率仍可達(dá)到66.78%，在pH 2時(shí)抑菌活性最低，但仍達(dá)到了68.67%.混合發(fā)酵液中的抗菌物質(zhì)具有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性及較強(qiáng)的耐強(qiáng)酸和強(qiáng)堿性，有良好的應(yīng)用潛力.

致病疫霉；梨黑斑病菌；白菜黑斑病菌；混合發(fā)酵；拮抗物質(zhì)

由致病疫霉（Phytophthorainfestans（Mont.）de Bary）引起的馬鈴薯晚疫病是馬鈴薯生產(chǎn)中最重要的病害，其危害性、防治難度及其對社會(huì)造成的影響已超過了水稻稻瘟病和小麥銹病，被視為國際第一大作物病害［1］.因此，對馬鈴薯晚疫病的生物防治也被提升到了一個(gè)新的高度.目前，對馬鈴薯晚疫病的生物防治主要利用微生物之間的拮抗［2］或預(yù)先處理誘導(dǎo)植物增強(qiáng)抗病性［3-4］等方法，其中拮抗實(shí)驗(yàn)多使用單一菌體進(jìn)行抑菌作用的探討，把2種或2種以上拮抗微生物進(jìn)行混合發(fā)酵，在抑制致病疫霉方面國內(nèi)外均鮮有報(bào)道［5-6］.本文在本實(shí)驗(yàn)室前期已明確梨黑斑病菌（Alternariaalternate）LH-03與白菜黑斑病菌（Alternaria brassicae）BH-09發(fā)酵液以一定比例混合后對致病疫霉的拮抗效果明顯優(yōu)于其單獨(dú)發(fā)酵液的基礎(chǔ)上［2］，對這2種真菌進(jìn)行混合發(fā)酵的可行性、混合發(fā)酵條件及發(fā)酵產(chǎn)物中抑菌活性的穩(wěn)定性方面進(jìn)行初步研究，以期為生產(chǎn)中利用抗菌物質(zhì)控制馬鈴薯晚疫病提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 供試菌種

致病疫霉（Phytophthorainfestans（Mont.）de Bary）Z102、2種拮抗真菌（梨黑斑病菌（Alternariaalternate）LH-03和白菜黑斑病菌（Alternariabrassicae）BH-09）均為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種.

1.2 2種拮抗真菌共培養(yǎng)的確定

將2種拮抗真菌在PDA平板上進(jìn)行對峙培養(yǎng)，觀察彼此之間有無拮抗作用，以確定能否共培養(yǎng).

1.3 2種拮抗真菌混合發(fā)酵條件的確定

［2］所報(bào)道的方法并稍作修改制備2種拮抗真菌的復(fù)合發(fā)酵液，以打孔器分別打取在PDA上活化4～7d的梨黑斑病菌和白菜黑斑病菌菌餅（φ＝7mm）各2個(gè)，一起放入100mL PDB（馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)液）中，按培養(yǎng)時(shí)間、初始pH值、培養(yǎng)溫度、光照、振蕩與靜置等不同單一條件進(jìn)行混合發(fā)酵，分別獲得發(fā)酵液，并通過抑菌實(shí)驗(yàn)逐一確定各項(xiàng)最佳培養(yǎng)條件.其中，培養(yǎng)時(shí)間分別為2，4，6，8，10，12，14，16d；培養(yǎng)基初始pH值分別為5.0，5.5，6.0，6.29（自然pH值），6.5，7.0，7.5，8.0；培養(yǎng)溫度分別為20，23，25，27，30℃；光照條件分別為全黑暗、20h黑暗／4h光照、12h黑暗／12h光照、4h黑暗／20h光照；振蕩條件分別為靜置24h、振蕩20min、靜置20min和振蕩24h；混合發(fā)酵液經(jīng)離心、過濾除菌后于4℃保存?zhèn)溆没蛑苯佑猛坎挤ǎ?］進(jìn)行抑菌活性的測定.以上各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)每種處理均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

抑菌率＝（對照菌落直徑-處理菌落直徑）／對照菌落直徑×100%.

1.4 混合發(fā)酵產(chǎn)物的最適抑菌質(zhì)量濃度測定

利用上述已確定的最佳發(fā)酵條件獲得混合發(fā)酵液，冷凍干燥后得混合發(fā)酵液干物質(zhì)，用無菌水將其配制成不同質(zhì)量濃度的溶液進(jìn)行抑菌活性測定.

1.5 混合發(fā)酵液中抗菌物質(zhì)對溫度及pH值的敏感性測定

取最適抑菌濃度的混合發(fā)酵液5mL分裝于5支離心管中，分別經(jīng)不同溫度（40，60，80，100℃水浴30min、121℃高溫濕熱滅菌30min）、不同pH 值（2.0，4.0，6.0，8.0，10.0）處理4h.高溫處理后自然冷卻至室溫，pH值處理后再調(diào)回到原pH值，采用涂布法進(jìn)行抑菌活性測定［5］，以未經(jīng)處理的同濃度發(fā)酵液作為對照.

2 結(jié)果與分析

2.1 2種真菌混合發(fā)酵可行性的確定

對梨黑斑病菌和白菜黑斑病菌進(jìn)行對峙培養(yǎng)的結(jié)果表明，2種真菌之間無相互抑制作用，2者的菌絲之間無抑菌帶（圖1），確定可以進(jìn)行混合發(fā)酵.

圖1 梨黑斑病菌和白菜黑斑病菌的對峙培養(yǎng)Fig.1 Dual-culture of A.alternate and A.brassicae

2.2 不同培養(yǎng)時(shí)間對混合發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性的影響

由圖2和圖3可以看出，不同培養(yǎng)時(shí)間對所得混合發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性影響不同.在復(fù)合發(fā)酵的0～16 d中，除培養(yǎng)時(shí)間為2d和12d的發(fā)酵液抑菌活性較低外，其余培養(yǎng)時(shí)間所得發(fā)酵液對致病疫霉菌絲生長的抑制率均達(dá)到65%以上，其中培養(yǎng)4d所得的抑菌率最高（91.96%），致病疫霉菌絲幾乎不生長；培養(yǎng)6d和10d所得的抑菌率次之，也均達(dá)到85%以上，以下各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中混合發(fā)酵時(shí)間均為4d.

圖2 培養(yǎng)時(shí)間對混合發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性的影響Fig.2 Effect of culture time on anti-fungi activity of mixed ferment liquid

圖3 培養(yǎng)時(shí)間對混合發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性的影響Fig.3 Effect of culture time on anti-fungi activity of mixed ferment liquid

2.3 不同初始pH對混合發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性的影響

不同初始pH對混合發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性的影響見圖4，總體表現(xiàn)為混合發(fā)酵產(chǎn)物對致病疫霉菌絲生長的抑制作用在偏酸性條件下（抑菌率均高于60.19%）比在偏堿性條件下強(qiáng)，混合發(fā)酵的pH越接近原始發(fā)酵液pH抑菌效果越顯著，以在原始pH（6.29）時(shí)抑菌率達(dá)到最高，為92.11%（圖4）.以下各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中混合發(fā)酵的初始pH值確定為6.29.

圖4 初始pH對混合發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性的影響Fig.4 Effect of initial pH on anti-fungi activity of mixed ferment liquid

2.4 不同培養(yǎng)溫度對混合發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性的影響

實(shí)驗(yàn)中測定了不同培養(yǎng)溫度對混合發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性的影響（圖5）.結(jié)果表明，在20～25℃內(nèi)所得混合發(fā)酵產(chǎn)物隨溫度升高抑菌率逐漸增加并達(dá)到最高，抑菌率由52.48%升至90.85%，但溫度繼續(xù)升高至27℃或30℃時(shí)，抑菌率急劇下降（不到20%）.以下各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中混合發(fā)酵的培養(yǎng)溫度確定為25℃.

圖5 發(fā)酵溫度對混合發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on anti-fungi activity of mixed ferment liquid

2.5 振蕩／靜置培養(yǎng)對混合發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性的影響

振蕩或靜置培養(yǎng)對混合發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性有顯著影響（圖6），在24h連續(xù)靜置和24h連續(xù)靜置中只振蕩20min的條件下，所得混合發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌率可分別達(dá)到91.48%和84.26%，相反，在24h連續(xù)振蕩和24h連續(xù)振蕩中只靜置20min的條件下，所得混合發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌率僅分別為9.26%和3.33%.以下各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中混合發(fā)酵均在24h靜置條件下進(jìn)行.

2.6 光照／黑暗培養(yǎng)對混合發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性的影響

光照或黑暗培養(yǎng)對混合發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性也有顯著影響.由圖7可見，在24h連續(xù)黑暗、20h黑暗／4h光照以及12h黑暗／12光照條件下，所得混合發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌率可分別達(dá)到91.11%，86.11%和55%，而在4h黑暗／20h光照及24h連續(xù)光照條件下，所得混合發(fā)酵產(chǎn)物均無明顯的抑菌作用，抑菌率不到3%.因此混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)宜在24h連續(xù)黑暗的條件下進(jìn)行.

至此，2種拮抗真菌的最佳混合發(fā)酵條件確定為：初始pH 6.29在25℃黑暗中靜置培養(yǎng)4d.

圖6 振蕩條件對混合發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性的影響Fig.6 Effect of vibration condition on anti-fungi activity of mixed ferment liquid

圖7 光照條件對混合培養(yǎng)抑菌活性的影響Fig.7 Effect of lightness condition on the anti-fungi activity of mixed ferment liquid

2.7 混合發(fā)酵產(chǎn)物的最適抑菌濃度確定

利用上述已確定的最佳混合發(fā)酵條件進(jìn)行混合發(fā)酵，獲得的混合發(fā)酵液經(jīng)冷凍干燥得到其干物質(zhì)質(zhì)量濃度為7mg／mL，用無菌水分別配制成6.3，4.9，3.5，2.1mg／mL和0.7mg／mL等質(zhì)量濃度的溶液后進(jìn)行了抑菌測定.結(jié)果顯示，在用量相同但質(zhì)量濃度不同時(shí)對致病疫霉菌絲生長有顯著不同的影響（表1）.供試6種不同質(zhì)量濃度的發(fā)酵產(chǎn)物，其抑菌率均在52%以上，均與對照達(dá)到極顯著差異；且隨發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)量濃度增加，抑菌率逐漸升高，至最高質(zhì)量濃度（7mg／mL）時(shí)抑菌率也達(dá)到最高（92.15%）.從經(jīng)濟(jì)實(shí)用等角度綜合考查不同質(zhì)量濃度混合發(fā)酵液的抑菌效果，可見混合發(fā)酵產(chǎn)物的最適抑菌質(zhì)量濃度為2mg／mL.

表1 不同質(zhì)量濃度混合發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌作用Tab.1 Inhibition rate of different mass concentration mixed fermentation

2.8 不同溫度處理對發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性的影響

不同溫度處理對發(fā)酵產(chǎn)物中抑菌物質(zhì)活性的影響見圖8.總體上隨處理溫度升高抑菌物質(zhì)的活性呈逐漸下降的趨勢，但抑菌率均在66%以上.其中以121℃高壓滅菌30min后抑菌活性下降幅度最大，與未進(jìn)行高溫處理的對照相比，降低了約26.9%，但其抑菌率仍達(dá)到了66.78%，仍保留有對照73.2%的抑菌活性；表明混合發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)具有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性.

圖8 溫度對混合發(fā)酵液中抗菌物質(zhì)活性的影響Fig.8 Effect of temperature on the stability of the antagonistic substance produced by mixed fermentation

2.9 不同pH處理對發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性的影響

由圖9可見，不同pH處理對所得發(fā)酵產(chǎn)物抑制致病疫霉菌絲生長的活性均有一定影響，與未進(jìn)行pH處理的對照（抑菌率90.96%）相比，抑菌率雖均有所降低，但均在68%以上，表明混合發(fā)酵產(chǎn)物具有較好的耐強(qiáng)酸和強(qiáng)堿性質(zhì).

圖9 pH對混合發(fā)酵液中抗菌物質(zhì)活性的影響Fig.9 Effect of pH on the stability of antagonistic substance produced by mixed fermentation

3 討論

利用拮抗微生物及其發(fā)酵產(chǎn)物抑制植物病原菌從而控制植物病害已有多年的研究歷史，并由此已開發(fā)出一些生防制劑用以植物病害的有效防治［7］.但單一微生物發(fā)酵產(chǎn)物的作用強(qiáng)度、穩(wěn)定性等均有一定的局限性，導(dǎo)致許多生防制劑在室內(nèi)、盆栽或溫室中防病效果十分突出，在田間卻受到極大限制甚至沒有防病效果［8］.因此，將不同拮抗微生物單獨(dú)發(fā)酵后的產(chǎn)物混合或直接將不同拮抗微生物進(jìn)行混合發(fā)酵，借助于發(fā)酵過程使不同拮抗微生物的發(fā)酵產(chǎn)物能夠互補(bǔ)、協(xié)同或增效，獲得混合發(fā)酵產(chǎn)物有可能是解決這一突出問題的途徑之一［8］.微生物混合發(fā)酵在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥、環(huán)保、食品、酶制劑［9-10］等方面均有廣泛應(yīng)用，但在生物防治中報(bào)道還不多見.田黎等［11］將2株抑菌范圍不同的海洋微生物菌株，進(jìn)行混合發(fā)酵條件優(yōu)化，結(jié)果有效地提高了菌株產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的抑菌活性，其抑菌活性比單獨(dú)發(fā)酵提高了200%，證明了2個(gè)不同菌株混合發(fā)酵的協(xié)同效應(yīng)大于單獨(dú)發(fā)酵混合后的累加效應(yīng)，對靶標(biāo)真菌的致畸作用明顯；朱峰等［12］對2株南海紅樹內(nèi)生真菌的混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)也充分證明了混合發(fā)酵技術(shù)有可能成為尋找新穎代謝產(chǎn)物的有效途徑；葛紅蓮等［13］在復(fù)合菌劑AR99防治辣椒青枯病研究中，發(fā)現(xiàn)復(fù)合菌的防效高于任何一株單一菌株，可達(dá)91.1%；本研究室前期的研究也表明拮抗真菌和放線菌的發(fā)酵產(chǎn)物復(fù)配［5］、不同拮抗放線菌進(jìn)行混合發(fā)酵所得產(chǎn)物［6］對致病疫霉的抑制作用也均顯著優(yōu)于拮抗菌單一發(fā)酵的抑菌效果；其中郭會(huì)婧等［2］發(fā)現(xiàn)梨黑斑病菌LH-03和白菜黑斑病菌BH-09單獨(dú)發(fā)酵的產(chǎn)物混合后抑菌效果明顯優(yōu)于單一發(fā)酵產(chǎn)物，在質(zhì)量濃度為10mg／mL時(shí)，2種菌發(fā)酵液的單獨(dú)抑菌率分別為74.8%和67.8%，而等體積混合后的抑菌率為89.8%，表明2種拮抗菌的發(fā)酵產(chǎn)物混合后可能產(chǎn)生了協(xié)同或增效作用［5］.本實(shí)驗(yàn)將這2種拮抗菌混合發(fā)酵后，所得產(chǎn)物在較低質(zhì)量濃度（7mg／mL）下的抑菌率為92.15%，明顯高于上述郭會(huì)婧等報(bào)道的2種菌發(fā)酵液混合后（質(zhì)量濃度為10mg／mL）的抑菌率（89.8%），表明梨黑斑病菌和白菜黑斑病菌混合發(fā)酵后更具有優(yōu)勢.但對于混合發(fā)酵所得產(chǎn)物的抗菌機(jī)制以及抑菌物質(zhì)的性質(zhì)等均有待進(jìn)一步深入研究，以便為今后利用該抗菌物質(zhì)奠定基礎(chǔ).

參 考 文 獻(xiàn)：

［1］宋伯符，謝開云.CIP的全球晚疫病防治倡議與我國的參與［J］.馬鈴薯雜志，1997，11（1）：51-55.

［2］郭會(huì)婧，蔣繼志，李向彬，等.致病疫霉拮抗菌篩選及復(fù)合發(fā)酵液的抑菌作用研究［J］.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，31（4）：87-90.

［3］蔣繼志，史娟，趙麗坤，等.幾種植物提取物誘導(dǎo)馬鈴薯對致病疫霉的抗性［J］.植物病理學(xué)報(bào)，2001，31（2）：145-151.

［4］蔣繼志，孫琳琳，郭會(huì)婧，等.幾種微生物提取物誘導(dǎo)馬鈴薯抗晚疫病及機(jī)理的初步研究［J］.植物病理學(xué)報(bào)，2010，40（2）：173-179.

［5］桂春爽，梁寧，蔣繼志.拮抗真菌和放線菌復(fù)配發(fā)酵產(chǎn)物對馬鈴薯晚疫病的防病作用［J］.河北大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，29（4）：416-420.

［6］蔣繼志，李莎，王會(huì)仙.3株致病疫霉拮抗放線菌混合發(fā)酵及其抑制機(jī)理［J］.河北大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，30（1）：78-82.

［7］PAL K K，TIKAK K B，SAXENA A K.Antifungal characteristics of fluorescent pseudomonas strain involved in the biological control of Rhizoctonia solani［J］.Microbiologoical Research，2000，155（3）：233-242.

［8］李春筍，郭順星.微生物混合發(fā)酵的研究及應(yīng)用［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2004，31（3）：156-161.

［9］楊艷紅，王伯初，時(shí)蘭春，等.復(fù)合微生物制劑的綜合利用研究進(jìn)展［J］.重慶大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，26（6）：81-85.

［10］WIESEL I，REHM H J，BISPING B.Improvement of tempe fermentations by application of mixed cultures consisting ofRhizopussp.and bacterial strains［J］.Appl Microbiol Biotechnol，1997，47：218-225.

［11］田黎，張久明，黃樂平，等.混合發(fā)酵提高2株海洋微生物菌株抑菌活性的研究［J］.微生物學(xué)報(bào)，2005，45（6）：871-875.

［12］朱峰，林永成.兩株南海紅樹內(nèi)生真菌混合發(fā)酵產(chǎn)生新生物堿marinamide和其甲酯［J］.科學(xué)通報(bào)，2006，51（7）：792-795.

［13］葛紅蓮，郭堅(jiān)華，祁紅英，等.復(fù)合菌劑 AR99防治辣椒青枯?。跩］.植物病理學(xué)報(bào)，2004，34（2）：162-165.

Mixed Fermentation of Two Antagonistic Fungi AgainstPhytophthorainfestansand Stability of Anti-fungi Substances

JIANG Ji-zhi1，WANG Xing-zhe1，WANG Hui-xian2
（1.College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002，China；2.Library，Hebei University，Baoding 071002，China）

To obtain the stable biocontrol preparation for controlling potato late blight，the feasibility of mixed fermentation for antagonistic fungiAlternariaalternateLH-03andA.brassicaeBH-09against growth ofPhytophthorainfestansand the fermentation conditions were investigated，and then the stability of antagonistic substance in fermentation filter was tested in this experiment.The results showed that there were no antagonistic effects for two antagonistic fungi.The mixed fermentation could increase the anti-fungi activity toP.infestans.The optimized conditions for mixed fermentation were pH 6.29，25℃，standing culture for 4days in the dark.Inhibition rate of fermentation liquid at optimized condition was up to 92.15%and stronger than that of two fungi fermentation independently.The fermentation product at optimized condition after treatment with different temperature and pH，its anti-fungi activity remained basically unchanged or declined slightly，especially for the inhibitory rate could reach 66.78%with high temperature treatment at 121℃，and 68.67%with pH 2treatment，respectively.It is indicated that the fermentation product at optimized condition had a great potential in control potato late blight in future since it displayed strong thermal stability and well resistance to superacid and strong alkali.

Phytophthorainfestans；Alternariaalternate；Alternariabrassicae；mixed fermentation；antagonistic substances

Q 945.8

A

1000-1565（2011）05-0515-07

2011-02-12

河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（C2011201003）

蔣繼志（1960-），男，寧夏中寧人，河北大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，主要從事植物病理方面的研究.

E-mail：jiangjizhi＠yahoo.com

趙藏賞）